افزايش كارآيي انتقال ژن به باكتري E. coli با استفاده از نانولوله‌هاي كربني كاتيوني

Increasing the Efficiency of Gene Transfer in E. coli Using Cationic Carbon Nanotubes

اهداف: در سال‌هاي اخير نانولوله‌هاي كربني به‌دليل ويژگي‌هاي منحصر به فرد خود توجه بسياري از محققان را به خود جلب كرده‌اند. در مطالعه حاضر، نانولوله‌هاي كربني با استفاده از PEI پوشش داده شدند. سپس توانايي آنها براي انتقال ژن به سلول‌هاي باكتري اشريشياكلي ارزيابي شد. مواد و روش‌ها: نانوذرات نانولوله- PEI از طريق برهم كنش بين گروه‌هاي آمين موجود در PEI با گروه‌هاي كربوكسيل نانولوله‌ها سنتز شدند. به‌منظور تهيه سازه ژني مناسب براي انتقال به باكتري E. coli ژن Gus A از وكتور pBI121 به وكتور PUC-18 انتقال يافت (pUC-Gus). سپس كمپلكس‌هاي نانولوله- PEI- DNA با تركيب نسبت‌هاي متفاوت وزني (درصد وزني/وزني) از نانوذرات نانولوله- PEI (0/5، 1 و 2) با مقدار ثابت از وكتور pUC-Gus تهيه شدند و توسط ژل آگارز مورد بررسي قرار گرفتند. به‌منظور ترانسفورماسيون باكتري E. coli، مقدار مناسبي از كمپلكس نانولوله- PEI- DNA به باكتري‌هاي E. coli اضافه شد. سپس به مدت 7 ساعت در دماي °C37 شيك شدند. بازده ترانسفورماسيون باكتري‌ها از طريق شمارش كلني و با استفاده از محيط LB جامد حاوي آنتي‌بيوتيك آمپي‌سيلين بررسي شد. علاوه بر اين از رنگ‌آميزي Gus به‌منظور تاييد عملكرد پلاسميد ترانسفورم‌شده استفاده شد. تعيين سميت نانولوله- PEI با استفاده از روش MTT و در بازه‌هاي زماني 6، 24 و 72 ساعت با غلظت‌هاي مختلف 10، 100 و 500ميكروگرم بر ميلي‌ليتر مورد بررسي قرار گرفت. يافته‌ها: نانوذرات نانولوله- PEI با موفقيت سنتز شدند. نانولوله‌هاي كربني كاتيوني از قابليت بالايي براي محافظت از DNA در برابر آسيب‌هاي ناشي از آنزيم‌هاي برشي برخوردار بودند. با افزايش غلظت نانوذرات نانولوله- PEI و همچنين مدت زمان انكوباسيون، درصد زنده‌ماني باكتري‌ها كاهش يافت. نتايج حاصل از الكتروفورز ژل آگارز از پلاسميد استخراج‌شده از باكتري‌هاي ترانسفورم‌شده پس از برش توسط آنزيم EcoRΙ نشان داد كه پلاسميد pUC-Gus با موفقيت توسط نانوذرات نانولوله- PEI به سلول‌هاي باكتري E. coli انتقال يافته‌اند. نتيجه‌گيري: نانولوله‌هاي كربني كاتيوني توانايي بالايي در انتقال ژن به باكتري E. coli دارند.

Aims In recent years, carbon nanotubes have attracted the attention of many researchers because of their unique properties. In the present study, carbon nanotubes were coated using PEI. Then, their ability to gene delivery to E. coli cells was examined. Materials & Methods Nanotube-PEI nanoparticles were synthesized by the reaction between amine groups of PEI and carboxyl groups of nanotubes. In order to prepare the appropriate DNA vector for delivering to E. coli cells, the Gus A gene was transferred from pBI121 to PUC18 vector (pUC-Gus). Nanotube-PEI/DNA complexes were prepared by combining different mass ratios of nanotube-PEI (0.5, 1, and 2 w/w%) with the fixed amount of DNA. To the transformation of E. coli, the appropriate amount of nanotube-PEI/DNA complexes was added to E. coli cells under stirring at 37°C for 7h. The transformation efficiency of E. coli was determined by colony counting on LB agar supplemented with Ampicillin. Moreover, Gus staining assay was used to confirm the function of the plasmid. Determination of cytotoxicity of nanotube-PEI was performed using MTT assay at 6, 24, and 72 hours intervals at different concentrations of nanotube-PEI (10, 100, and 500μg/ml). Findings The nanotube-PEI was synthesized successfully. Nanotube-PEI nanoparticles have a great ability to protect DNA from enzymatic digestion. The percentage of E. coli cells viability was decreased by increasing both the concentration of nanotube-PEI nanoparticles and also the duration of incubation. The results of the agarose gel electrophoresis of plasmid extracted from E. coli and digested using EcoRI enzyme showed that the pUC-Gus plasmid has been successfully transfected by nanotube-PEI nanoparticles to E. coli bacterial cells. Conclusion Cationic carbon nanotubes have a high ability to gene transfer to E. coli.