مرکز منطقه ای اطلاع رساني علوم و فناوري - كلون، بيان، تخليص و تعيين خصوصيات بيوشيميايي آنزيم كربوكسي پپتيداز G2

چكيده فارسي :

متوتروكسات يكي از داروهاي پرمصرف در شيمي درماني است كه نارسايي كليوي يكي از عوارض جانبي آن است. آنزيم كربوكسي پپتيدازG2 (گلوكارپيداز تحت نام تجاري وراكساز) آنزيمي باكتريايي است كه ميتواند متوتروكسات را به متابوليت‌هاي غيرفعال خود تبديل كند و پس از درمان با دز بالاي متوتروكسات، منجر به حذف آن از مسير غيركليوي مي‌شود. روش كار: در اين پروژه ابتدا ژن كربوكسي پپتيداز G2 به دست آمده از سايتNCBI (Accession number: ACY05517) در داخل وكتور pUC57 توسط شركتGene Cust سنتز شد ,سپس براي ادامه روند، وكتور pUC57 كه حاوي ژن كربوكسي پپتيداز G2 بود از باكتري استخراج شد و به عنوان الگو در واكنش PCR به همراه پرايمرهاي داراي سايت برشNdeI و XhoIمورد استفاده قرار گرفت. پس از آن بر روي محصولPCR هضم آنزيمي صورت گرفت و در بين سايت‌هاي مورد نظر در وكتور بياني pET28a كلون گرديد. در نهايت پلاسميد نوتركيب به داخل سويه بياني E. coli BL21 ترنسفورم شد و تعدادي از پلاسميدهاي تاييد شده از طريق Colony PCR براي تعيين توالي با پرايمر T7 promotor و T7 terminator، ارسال شدند. نتايج تعيين توالي نيز حضور ژن را تاييد كردند، پس از آن بيان تحت شرايط بياني مختلف بهينه گرديد. يافته‌ها: بيشترين سطح بيان در غلظت 5/0 ميلي مولار IPTG دماي 25 درجه سانتيگراد و مدت زمان انكوباسيون 6 ساعت تعيين شد. در انتها پروتئين مورد نظر از طريق كروماتوگرافي تمايلي نيكل آگارز تخليص و ويژگي هاي سينتيكي آن بررسي شد. pH و دماي بهينه فعاليت آنزيم به ترتيب 7 و ˚C25 به دست آمد. براي سوبستراي متوتروكسات μM 24Km= و μmol/min 005431/0 Vmax = محاسبه شد. نتيجه‌‌گيري: اين مطالعه به منظور توليد و فرآوري آنزيم كربوكسي پپتيداز G2 بوده و در آينده اين آنزيم مي‌تواند كانديداي بالقوه اي براي كاهش اثرات جانبي شيمي درماني باشد.