ساخت سويه بياني پيكيا پاستوريس مولد قطعه‌ي تك‌زنجيره‌اي ناحيه‌ي ‌متغير آنتي‌بادي عليه ناحيه خارج سلولي EpCAM

هدف: مولكول چسباننده سلول‌هاي اپيتليال (EpCAM) در سطح سلول‌هاي توموري اپيتليال به طور فزاينده‌اي بيان مي‌شود. بنابراين EpCAM يك آنتي‌ژن با ارزش در درمان هدفمند محسوب مي‌شود. استفاده از آنتي‌بادي‌هاي منوكلونال رويكردي جذاب در درمان هدفمند سرطان است. محدوديت‌هاي آنتي‌بادي‌هاي منوكلونال نظير اندازه‌ي بزرگ منجر به توسعه قطعات تك‌زنجيره‌اي ناحيه متغير آنتي‌بادي (scfv) شد. پيكيا پاستوريس به علت انجام فرايندهاي پس از ترجمه و قيمت ارزان به عنوان ميزباني مناسب در بيان پروتئين‌هاي نوتركيب در مقياس بالا مورد توجه است. در اين مطالعه، پيكيا پاستوريس بيان‌كننده scfv عليه قسمت خارج سلولي (EpEX) EpCAM ساخته شد. مواد و روش‌ها: ژن بهينه شده‌ي كدوني مولد پروتئين anti-EpEX-scfv در سايت‌هاي آنزيمي XhoI و XbaI وكتور pPICZαB وارد شد. صحت سازه نوتركيب به كمك توالي‌يابي و آناليز آنزيمي تأييد شد. سازه نوتركيب با كمك الكتروپوراسيون در سويه GS115 وارد شد. كلون‌هاي مثبت با كمك PCR و با به‌كارگيري سه جفت پرايمر ارزيابي شدند. يافته‌ها: صحت سازه نوتركيب با استفاده از آنزيم‌هاي HindIII وBamHI (باندهاي 2788 و 1537 جفت باز) هم‌چنين XhoI و XbaI (باندهاي 3506 و 819 جفت باز) تأييد شد. كلون‌هاي نوتركيب با كمك PCR با مشاهده دو باند (2200 و 1321 جفت باز) زماني‌كه دو پرايمر AOX استفاده شد، هم‌چنين يك باند (968 جفت باز) زماني‌كه پرايمر AOX و پرايمر اختصاصي ژن استفاده شد، تأييد شد. هنگامي‌كه دو پرايمر اختصاصي ژن به‌كار گرفته شد، يك باند (751 جفت باز) مشاهده شد. نتيجه‌گيري: اين يافته‌ها ساخت سويه مهندسي شده را تأييد مي‌كند. پروتئين anti-EpEX-scfv مي‌تواند انتخابي مناسب در زمينه‌ي ايمني‌درماني سرطان باشد.

Introduction: Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is highly expressed on epithelial tumors. So, EpCAM is a valuable antigen for targeted therapy. Using monoclonal antibodies (mabs) is an attractive approach for targeted cancer therapy. Importantly, limitations of intact mabs including large size led to the development of antibody fragments such as single chain fragment variable (scfv). Pichia pastoris is considered as a suitable host for large-scale production of recombinant proteins because of post-translation modification system and low cost. Here, the Pichia expressing a scfv against EpCAM extracellular domain (EpEX) was constructed. Materials and Methods: The codon optimized gene encoding anti-EpEX-scfv protein was cloned in the XhoI and XbaI sites of the pPICZαB vector. The recombinant plasmid was confirmed by restriction enzyme analysis and sequencing. The constructed plasmid was integrated into GS115 strain by electroporation. Positive clones were evaluated by PCR using three sets of primers. Results: Restriction enzyme analysis utilizing HindIII and BamHI (2788, 1537 bp bands), as well as XhoI, XbaI (3506, 819 bp bands) confirmed construction of recombinant pPICZαB-anti EpEX- scfv. In this way, PCR based screening results of integrants showed two bands (2200 and 1321 bp), when AOX1 primer set was used as well as one band (968 bp) when the 3´ insert-specific primer paired with 5´ AOX1 primer. There was one band (751 bp) in PCR result of confirmed integrants when insert-specific primer set was utilized. Conclusion: These findings imply that the engineered strain was constructed. The anti-EpEX-scfv protein can be used as a potential candidate in cancer immunotherapy