كلون‌كردن DNA و بيان پروتئين آلفا- سينوكلئين در باكتري اشريشياكلي

اهداف: شناخت ساختار و عملكرد پروتئين آلفا سينوكلئين مي‌تواند زمينه‌ساز توسعه روش‌هاي درماني مناسب عليه بيماري پاركينسون باشد. هدف پژوهش حاضر، كلون‌كردن DNA و بيان پروتئين آلفا سينوكلئين در باكتري اشريشياكلي بود. مواد و روش‌ها: در پژوهش تجربي حاضر، توالي كدكننده آلفا سينوكلئين موجود در پلازميد نوتركيب pRK۱۷۲، به كمك روش PCR و با استفاده از پرايمرهاي مناسب تكثير شد. DNA سنتزشده توسط آنزيم‌هاي محدودگر SalI وHindIII بريده و در حامل‌ pET۲۸a كلون و پلازميد نوتركيب به روش كلسيم كلرايد به سويه بياني باكتري اشريشياكلي (BL۲۱) منتقل شد. بيان آلفاسينوكلئين توسط محلول IPTG القا و بيان پروتئين نوتركيب با روش الكتروفورز SDSPAGE ارزيابي شد. رديف‌سازي توالي‌ها به كمك الگوريتم ClustalW با برنامه BioEdit ۵.۰.۹ صورت پذيرفت. يافته‌ها: در محصولات واكنش‌هاي برش آنزيمي DNA و پلازميد pET۲۸a با آنزيم‌هاي محدودگر، اندازه قطعات، نشان‌دهنده صحت واكنش‌هاي آنزيمي بود. DNA تكثيرشده و پلازميد pET۲۸a مورد استفاده به‌ترتيب با طول‌هاي ۴۰۷ و ۵۳۶۹ نوكلئوتيد بودند. ترجمه حاصل از توالي قطعه كلون‌شده، تشابه ۱۰۰% با پروتئين آلفا سينوكلئين انساني را نشان داد. در بيان پروتئين نوتركيب در قياس با نمونه‌هاي شاهد منفي، افزودن IPTG موجب افزايش بيان پروتئين آلفا سينوكلئين در تمامي نمونه‌ها به‌ويژه ۲ ساعت پس از القا شد. بيشتر آلفا سينوكلئين بيان‌شده از پلازميد pET۲۸aalphaSynuclein به‌صورت اجسام گنجانده در باكتري تجمع يافتند. نتيجه‌گيري: پروتئين آلفا سينوكلئين در پلازميد pET۲۸a كلون و تشكيل اجسام گنجانده توسط آلفا سينوكلئين به‌هنگام بيان از سامانه pET۲۸aalphaSynuclein تاييد مي‌شود و راه را بر توليد اين پروتئين در مقياس بالا هموار مي‌سازد.