توليد انگلهاي نوتركيب ليشمانيا تروپيكا بيان كننده دو پروتئين گزارشگرEGFP و لوسيفراز

سابقه و هدف: انگل ليشمانيا تروپيكا عامل بروز ليشمانيوز پوستي و احشايي در ايران است. بعلت فقدان يك آزمون دقيق، حساس و غيرتهاجمي در مدل حيواني، درمان و واكسيناسيون برعليه آن با چالش بزرگي همراه است. لذا در اين مطالعه، ليشمانيا تروپيكا با دو ژن گزارشگر پروتئين فلورسنت سبز (egfp) و لوسيفراز (luc) به شكل اتصال يافته (egfpluc) ترانسفكت شد تا در مطالعات آتي بعنوان يك ابزار تشخيصي سريع و دقيق براي رديابي و اندازه گيري ميزان عفونت در بدن حيوان زنده مورد استفاده قرار گيرد. مواد و روش ها: در اين مطالعه آزمايشيتجربي، سازه ژني حاوي ژنهاي egfpluc از طريق نوتركيبي مشابه در ژنوم سويه ايراني انگل ليشمانيا تروپيكا (در لوكوس 18srRNA) درج شد. براي غربالگري انگلهاي ترانسفكت شده، از شاخص انتخابي G418 استفاده گرديد. سپس بوسيله PCR با پرايمرهاي مختلف ژنوتيپ انگلها بررسي شد. همچنين با استفاده از وسترن بلات، ميكروسكوپ فلورسنت و فلوسايتومتري بيان پروتئينهاي گزارشگر ارزيابي شد. يافته ها: مشاهدات اوليه فنوتيپي انگل با استفاده از ميكروسكوپ فلورسنت نشان داد كه انگلهاي نوتركيب L. tropicaEGFPLUC پروتئين EGFP را در سيتوپلاسم توليد كرده اند. ميزان كمي شدت فلورسنت اندازه گيري شده در انگلهاي نوتركيب با استفاده از فلوسايتومتري بيش از 90% بود. نتايج آزمونهاي PCR ورود ژنها را بدرون ژنوم و لوكوس مربوطه و وسترن بلات بيان هر دو ژن را در شكل پروماستيگوت انگل نشان دادند. نتيجه گيري: اين اولين گزارش مبني بر توليد انگلهاي نوتركيب ليشمانيا تروپيكا بيان كننده هر دو ژن گزارشگرegfp و luc بطور همزمان است.