طراحي و ساخت كانستركت نوتركيب واجد ژن اينترفرون بتاي جهش يافته در ناحيه‌ كزاك (Kozak) به منظور تشديد ترجمه

زمينه و هدف: اينترفرون بتا يكي از مهمترين اعضاي گروه I اينترفرون ها بوده و به عنوان داروي اصلي در بسياري از بيماري ها از جمله بيماري مالتيپل اسكلروزيس استفاده مي شود. پروتئين اينترفرون بتا واجد نيمه ي عمر كمي بوده و لذا بيماران به دريافت مكرر دارو نيازمند مي باشند. با توجه به اهميت دارويي پروتئين اينترفرون بتا، امروزه تلاش هاي گسترده اي در جهت بهبود سطح ترجمه و افزايش توليد آن صورت پذيرفته است. چندين عامل مهم مي تواند بر روي ميزان بيان پروتئين در سلول تأثير گذار باشند كه توالي مناسب احاطه كننده كدون آغاز (توالي كزاك) از جمله ي آن موارد مي باشد. روش كار: پرايمرهاي اختصاصي جهت ايجاد جهش هدفمند در توالي كزاك با استفاده از روش SOEing PCR (Splicing by overlap extension / Splicing by overhang extension (SOE) PCR) طراحي و PCR انجام شد. به منظور ايجاد جهش مورد نظر در ژن اينترفرون بتا سه واكنش PCR انجام پذيرفت. محصول نهايي جهش يافته و پلاسميد pSVM، برش داده شده و متعاقبا اتصال بين محصولات برش داده شده توسط ليگاز انجام گرفت. پس از ترانسفورماسيون با استفاده از مخلوط لايگيشن، استخراج پلاسميد صورت گرفت. پس از توليد كانستركت و تأييد با استفاده از روش هاي هضم آنزيمي و PCR كانستركت نوتركيب به رده ي سلولي CHO با استفاده از كيت ليپوفكتامين ترانسفكت گرديد. يافته ها: در تحقيق حاضر با استفاده از روش هاي مهندسي ژنتيك كانستركت نوتركيب اينترفرون بتا توليد گرديد. در اين كانستركت با استفاده از روش SOEing PCR و ايجاد جهش هاي هدفمند در ناحيه ي توالي كزاك، توالي مذكور به حالت ثابت نزديك گرديد. كلني هاي سفيد رنگ بر روي محيط كشت پس از ترانسفورماسيون مشاهده گرديد. استخراج پلاسميد از كلني ها انجام گرفته و صحت كانستركت نوتركيب با استفاده از هضم آنزيم و همچنين PCR تأييد گرديد. طول قطعه ي ايجاد شده پس از هضم آنزيمي صحت كلون نمودن ژن نوتركيب اينترفرون بتا را تأييد نمود. پس از تأييد فرايند كلونينگ، سلول هاي CHO كشت داده شده و ترانسفكشن پلاسميد نوتركيب به رده ي سلولي CHO صورت گرفت. نتيجه گيري: جهش هدفمند در توالي كزاك ژن اينترفرون بتا صورت گرفت. جهش مورد نظر بر روي توالي كزاك مي تواند سبب بهبود و افزايش ميزان ترجمه پروتئين اينترفرون بتا گردد. در مراحل بعدي ميزان تأثير جهش در روند توليد پروتئين با استفاده از روش ELISAبررسي خواهد شد.