بيان و تخليص DNA پليمراز Pfu متعلق به خانواده‌ي B

مقدمه: DNA پليمرازها آنزيم‌هايي هستند كه سنتز مولكول DNA را از دئوكسي ريبونوكئوتيدها بر عهده دارند. اين آنزيم‌ها ابزارهاي ضروري در زيست شناسي مولكولي به حساب مي‌آيند. DNA پليمراز Pfu از يك آركئوباكتري گرمادوست كه در رسوبات دريايي با دماي 100-90 درجه‌ي سلسيوس زندگي مي‌كند، جدا گرديده است. اين آنزيم، خصوصيت اگزونوكلئازي ۳ به ۵ را دارد كه باعث اصلاح خطاهاي ناشي از همانندسازي DNA مي‌شود. روش‌ها: در اين مطالعه، قطعه‌ي كد كننده‌ي ژن DNA پليمراز Pfu در ناقل بياني b15-pET كلون گرديد. سپس با تغيير شرايط بيان مانند غلظت IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)، زمان و دماي القا، بيان اين آنزيم بهينه شد. در نهايت در شرايط بهينه، پروتئين در مقياس بالا تهيه و به روشي ساده تخليص گرديد. سپس آنزيم تخليص شده، جهت بررسي فعاليت در واكنش PCR (Polymerase chain reaction) به كارگرفته شد. يافته‌ها: كلوني‌هايي بعد از ترانسفورماسيون پلاسميد نوتركيب ايجاد شد كه اكثر آن‌ها حاوي پلاسميد بودند. بيان آنزيم Pfu باندي را در حدود KD ۹۰ در ژل الكتروفورز SDS-PAGE (Sodium do decyl sulfate- Polyacrylamide gel electrophoresis) نتيجه داد. بيشترين ميزان توليد پروتئين با غلظت ۷۵/۰ ميلي‌مولار ماده‌ي القا كننده‌ي IPTG، دماي ۳۷ درجه‌ي سلسيوس و ۳ ساعت پس از القا مشاهده شد. نتيجه‌گيري: تخليص پروتئين با به كارگيري روشي جديد بر مبناي پروتكل Desai منجر به ايجاد محصولي شد كه در واكنش PCR فعاليتي مشابه با نمونه‌ي تجاري داشت.