مقايسه‌ي تعداد نسخه‌هاي درج شده‌ي ژن 10-IP با استفاده از سيستم تك پلاسميدي و دو پلاسميدي بر اساس سيستم ترانسپوزوني PiggyBac در ژنوم سلول‌هاي Human embryonic kidney

مقدمه: يكي از چالش‌هاي پيش رو در روش‌هاي مرسوم توليد پروتئين نوتركيب كه ترانسژن به صورت خطي به سلول ميزبان وارد مي‌شود، هتروژني در تعداد نسخه‌‌هاي ترانسژن در كلون‌هاي مختلف به دست آمده است كه منجر به بيان ژن در سطوح مختلف مي‌شود. گذشته از كارايي پايين درج خطي در ژنوم ميزبان، پديده‌اي ديگر به نام Position effect باعث كمتر شدن كارايي بيان ژن مي‌گردد. PiggyBac كلاسي از DNA ترانسپوزوني است كه مي‌تواند به صورت مكانيزم Cut and paste در ژنوم سلول ميزبان جابه‌جا شود. برخي خصوصيات منحصر به فرد اين ترانسپوزون، آن را به يكي از وكتور‌هاي مناسب در مطالعات انتقال ژن تبديل كرده است. انتقال ترانسژن با حجم بالا و درج در نواحي فعال از نظر رونويسي، از جمله خصوصيات مهم اين ترانسپوزون است كه مي‌توان از آن در توليد پروتئين نوتركيب با كارايي بالا بهره برد. در اين تحقيق، تعداد نسخه‌‌هاي درجي در كلون‌هاي به دست آمده از سيستم تك پلاسميدي و دو پلاسميدي اين سيستم در رده‌ي سلولي HEK (Human embryonic kidney) مقايسه شده است. روش‌ها: توليد سازه‌‌هاي تك پلاسميدي و دو پلاسميدي سيستم ترانسپوزاز حاوي ژن 10-IP و ژن مقاومت به آنتي بيوتيك هيگرومايسين با استفاده از روش‌هاي كلونينگ مولكولي به انجام رسيد. رده‌ي سلولي HEK پس از تكثير در پليت‌هاي سلولي جهت انجام ترانسفكشن Seed شدند. سازه‌‌ها با استفاده از كيت ليپوفكتامين 2000 ترانسفكت شدند و پس از 48 ساعت مورد تيمار با آنتي بيوتيك هيگرومايسين به مدت دو هفته قرار گرفتند. كلون‌هاي به دست آمده پس از استخراج DNA ژنومي با تكنيك Absolute real-time PCR (Absolute real-time polymerase chain reaction) از نظر تعداد نسخه‌‌هاي ژني درج شده مورد بررسي قرار گرفتند. يافته‌ها: تعداد نسخه‌‌هاي ژني به دست آمده با استفاده از سيستم تك پلاسميدي در هر سلول، برابر با 5 نسخه بود؛ در حالي كه اين عدد در سيستم دو پلاسميدي برابر با دو نسخه بود. نتيجه‌گيري: بررسي نتايج حاصل از تعداد نسخه‌‌هاي درجي در سيتم‌‌هاي تك پلاسميدي و دو پلاسميدي نشان داد كه سيستم تك پلاسميدي كارايي بالاتري از لحاظ تعداد نسخه‌‌هاي درجي دارد و مي‌توان با كلون كردن ژن مورد نظر و كاست بيان كننده‌ي آنزيم ترانسپوزاز در يك پلاسميد واحد، تعداد نسخ بيشتري جهت بيان بيشتر پروتئين نوتركيب به دست آورد.