كلونينگ، بيان و ارزيابي فعاليت اگزوتوكسين A نوتركيب سودوموناس آئروژينوزا

مقدمه: امروزه در بسياري از مطالعات مربوط به درمان سرطا‌ن‌هاي مختلف، از هدفمند نمودن تركيبات سمي عليه سلول‌هاي سرطاني استفاده مي‌شود. يكي از اين تركيبات بسيار مؤثر، اگزوتوكسين A سودوموناس مي‌باشد. هدف از اين مطالعه، بررسي بيان و تخليص و ارزيابي فرم كوتاه شده‌اي از اين توكسين در سيستم بياني پروكاريوتي بود. روش‌ها: در ابتدا توالي فرم كوتاه شده‌ي توكسين (38PE) با استفاده از پرايمرهاي داراي جايگاه برش آنزيمي HindIII و NdeI از روي وكتور 57-pUC حاوي اين ژن تكثير شد. بعد از برش آنزيمي، داخل وكتور b26-pET خطي شده با اين آنزيم‌هاي برشي كلون گرديد. ارزيابي و تأييد ساختار وكتور نوتركيب به وسيله‌ي هضم آنزيمي و تعيين توالي، مورد بررسي قرار گرفت. وكتور نوتركيب به داخل باكتري‌هاي (3DE)21BL، plysS(3DE)21BL و Rosetta ترانسفورم شد و بعد از بيان و تخليص توكسين، ارزيابي عملكرد آن در سلول‌هاي يوكاريوتي HUVEC و KDR293 انجام شد. يافته‌ها: توالي ژن توكسين با موفقيت تكثير گرديد و با هضم آنزيمي و تعيين توالي صحت كلونينگ اثبات گرديد. وكتور نوتركيب در E.coli (Escherichia coli) بيان و به وسيله‌ي توالي هيستيديني با موفقيت تخليص گرديد. در نهايت، توكسيسيتي توكسين تخليص شده توسط آزمايش MTT (bromide diphenyltetrazolium-5،2-(yl-2-Dimethylthiazol-5،4)-3) بر روي دو رده‌ي سلول يوكاريوتي KDR293 و HUVEC مورد بررسي قرار گرفت. نتيجه‌گيري: با توجه به ساخت موفقيت‌آميز وكتور نوتركيب 38PE-b26-pET و ترانسفورم آن به داخل سلول‌هاي پروكاريوتي، ميزان بيان در سلول‌هاي مختلف E.coli متفاوت بود؛ به گونه‌اي كه ميزان بيان آن در (3DE)21BL بيشتر بود. از آن جايي كه قسمت اتصالي توكسين در فرم كوتاه شده وجود ندارد، بنابراين در ارزيابي سلولي بر اساس مطالعه‌ي قبلي، دوز كشندگي آن بيش از هزار برابر بيشتر از نوع هدفمند شده‌ي آن با عامل رشد عروقي 121VEGF مي‌باشد.