بهينه سازي استخراج ليپو پلي ساكاريد سويه خشن بروسلا آبورتوس به روش فنل – كلروفورم – پتروليوم اتر

Optimization of Rough Lipopolysaccharide Extraction from Brucella abortus by Phenol – Chloroform - Petroleum ether

مقدمه : بيماري بروسلوز يك بيماري مشترك بين انسان و دام بوده كه يك تهديد براي بهداشت عمومي و همچنين صنعت پرورش دام محسوب مي شود. هدف از اين مطالعه بهينه سازي روش استخراج ليپو پلي ساكاريد بروسلا آبورتوس سويه سويه خشن كه مي توان از آن به عنوان آنتي ژن در تستهاي سرولوژيك جهت تشخيص گاوهاي واكسينه با اين واكسن استفاده نمود مواد و روش ها : اين مطالعه كاربردي در آزمايشگاه تحقيق- توليد بخش بروسلوز انجام شد. به اين منظور ابتدا سويه خشن با روش كشت در محيط اختصاصي بروسلا آگار تكثير و با روش PCR مورد تاييد نهايي قرار گرفت و ليپو پلي ساكاريد خشن باكتري بروسلا آبورتوس به روش فنل – كلروفورم – پتروليوم اتر استخراج گرديد و نتايج حاصل از استخراج LPS خشن به كمك روشهاي LAL و SDS – PAGE مورد تائيد قرار گرفت. نتايج : در روش فنل – كلروفورم – پتروليوم اتر ليپو پلي ساكاريد خشن پس از استخراج و ترسيب با محلول متانول تست LAL صورت گرفت كه ايجاد لخته، نشانگر وجود LPS بود. همچنين الكتروفورز در ژل ( پلي آكريلاميد 14 درصد ) با رنگ آميزي نيترات نقره باندي كمتر از 14 كيلو دالتون مشاهده گرديد. نتيجه گيري : اين مطالعه روش فنل – كلروفورم – پتروليوم اتر يك روش ايده آل جهت استخراج ليپو پلي ساكاريد خشن ( R – LPS ) سويه خشن بوده و براي تهيه آنتي ژن در تستهاي سرولوژيك و همچنين كيت الايزا جهت تشخيص گاوهاي واكسينه با اين واكسن استفاده مي شود.

Brucellosis is an important zoonotic disease which threatens public health and livestock industry. The aim of this study was to optimize extraction of rough lipopolysaccharide from Brucella abortus which can be used as the antigen for the development of serological tests to diagnose vaccinated animals. This applied study was performed in the Brucellosis Research and Production Laboratory. For this purpose, the rough strain was cultured in Brucella agar specific medium and final diagnosis was performed by PCR method. The rough lipopolysaccharide of Brucella abortus was extracted by phenol-chloroform-petroleum ether method and the results of rough LPS extraction were approved by LAL and SDS - PAGE methods. Extraction and precipitation of Lipopolysaccharide with cold methanol and sodium acetate was performed by using Phenol – Chloroform - Petroleum ether method. Then Lipopolysaccharide was identified by Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test and formation of clots indicated presence of Lipopolysaccharide. Also SDS – PAGE (14 % Polyacrylamide gel) followed by silver nitrate staining showed a 12 KDa band which indicates Rough Lipopolysaccharide. According to the results of this study, it seems that Phenol – Chloroform - Petroleum ether method is an excellent method for extraction of rough LPS of antigen for the development of serological tests and ELISA Kit to diagnose vaccinated animals.