بررسي القاي آپوپتوز از طريق فعال سازي كاسپاز9 توسط تركيب سيلي بينين در رده سلولي HUVEC

Investigation of apoptosis induction through caspase 9 activation by silibinin in Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

سيلي بينين يك فلاونوئيد طبيعي است كه با توجه به مطالعات صورت گرفته، توانايي مهار رشد سرطان از طريق القاي آپوپتوز در انواع سلول‌هاي سرطان و همچنين سلول‌هاي اندوتليالي _كه نشانگر اثرات ضد‌رگزايي آن مي‌باشد_ را دارد اما مكانيسم مولكولي آن به خوبي مشخص نشده است. در اين مطالعه ما شواهدي مبني بر يكي از مكانيسم‌هايي كه سيلي بينين از طريق آن به القاي آپوپتوز در سلول‌هاي اندوتليال بند ناف جنين HUVEC مي‌پردازد، فراهم آورديم. بدين منظور، سلول‌هاي HUVEC در پليت هاي 96 خانه كشت داده شدند و توانايي سيلي بينين در مهار تكثير سلول HUVEC با روش تست MTT سنجيده شد و ميزان IC50، 143ميكرومولار مشخص گرديد. سنجش فعاليت كاسپاز9 بر اثر تيمار وابسته به غلظت)300-100 ميكرومولار( و وابسته به زمان(48،24 و 72 ساعت) در غلظت 100 ميكرومولار سيلي بينين با استفاده از سوبستراي كروموژنيك LEHD-PNA انجام گرفت كه بيشترين فعاليت كاسپاز 9 در غلظت 100 ميكرومولار سيلي بينين پس از 48 ساعت تيمار مشاهده شد. سنجش قطعه قطعه شدن DNA بر اثر تيمار وابسته به غلظت)400-100 ميكرومولار( با سيلي بينين انجام گرفت و اسمير درنمونه DNA استخراج شده از سلول هاي تيمار شده با غلظت 400 ميكرو مولار مشاهده شد. اطلاعات بدست آمده از اين مطالعه، توانايي سيلي بينين در مهار تكثير سلول‌هاي HUVEC از طريق القاي مرگ آپوپتوزي كه نشاني از عملكرد ضد رگزايي اين تركيب مي باشد را نشان مي دهد.

Silibinin a natural flavonoid has been reported to induce cell death in various types of cancers and also in endothelial cells which shows its anti-angiogenesis effect. However, its molecular mechanism is not clearly defined. In this article, we provided evidence for one of the mechanisms by which Silibinin induces apoptosis in HUVEC. For this purpose, HUVECs were grown on 96 well plates and cell viability was measured by MTT assay and IC50 was determined as 143μM after 24 hr of treatment by Silibinin. Caspase-9 activity in dose dependent (100-300μM) and time dependent (24,48 and 72hr) treatment by Silibinin was assessed using chromogenic substrate LEHD-pNA. Maximum activity of caspase 9 was in 100 μM of silibinin after 48 hours of treatment. DNA fragmentation was analyzed by gel electrophoresis. Cells were incubated with different concentrations of silibinin (100-400μM) and DNA that was extracted from cells which were incubated by 400 μM of silibinin formed a smear on agarose gel. Data obtained from this study showed the ability of Silibinin to inhibit HUVEC cell proliferation through apoptosis induction which indicates the anti-angiogenesis effect of this compound.