بهينه سازي فعاليت آنزيم اندوگلوكاناز Cel9A از باكتري آليسيكلوباسيلوس اسيدوكالداريوس با روش رويه پاسخ (RSM)

Activity optimization of Alicyclobacillus acidocaldarius endoglucanase Cel9A by Response surface methodology (RSM)

آنزيم اندوگلوكاناز Cel9A از باكتري آليسيكلوباسيلوس اسيدوكالداريوس (AaCel9A) يك آنزيم گرمادوست بوده و پيوندهاي بتا 1 به 4 را در مولكول سلولز به طور اتفاقي هيدروليز كرده و اليگوساكاريدهايي با سرهاي احيا كننده توليد مي‌كند. در اين تحقيق ابتدا وكتور pDEST17 حاوي ژن آنزيم AaCel9A جهت بيان پروتئين نوتركيب به ميزبان مناسب (اشريشيا كلي سويه BL21) منتقل شده و بعد از بيان، با استفاده از ستون نيكل آگارز خالص گرديد. سپس با توجه به تاثير گذاري pH، دما و كلسيم بر روي فعاليت و پايداري آنزيم، با استفاده از اين سه متغيير فعاليت آنزيم با استفاده از روش رويه پاسخ بهينه گرديد. نتيجه الكتروفورز ژل SDS-PAGE نشان داد كه آنزيم نوتركيب در حدود 59 كيلو دالتون وزن مولكولي داشته و به خوبي بيان و خالص شده است. نتايج روش رويه پاسخ نشان داد كه تاثير pH بر روي فعاليت آنزيم بيشتر از دما، و دما بيشتر از كلسيم بوده و بهينه شرايط فعاليت آنزيم AaCel9A در محيط با 35/6 pH، دماي°C5/64 و غلظت كلسيم برابر با 92/4 مولار است. در نهايت با توجه به همبستگي بالاي نتايج آزمايشگاهي و نتايج پيش بيني شده مي توان گفت مدل پيشنهادي در اين تحقيق براي پيش بيني شرايط بهينه فعاليت آنزيم از صحت بالايي برخوردار است.

Endoglucanase Cel9A from Alicyclobacillus acidocaldarius (AaCel9A), a thermophile enzyme, randomly breaks β1-4 glycosidic bond between glucose units in cellulose polymer and produces oligosaccharides with reducing end. In this study, first of all, E.coli BL21 cells were transformed by pDEST17 carrying AaCel9A enzyme gene for expression of the recombinant enzyme. After expression, the recombinant enzyme was purified by Ni-NTA affinity chromatography column and the purity of the recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE. Due to impact of the calcium, pH and temperature on AaCel9A activity, the effects of these parameters were investigated on AaCel9A activity to optimize activity condition by using Response surface methodology. The SDS-PAGE result showed that AaCel9A, with molecular weight of 59 kDa, was expressed and purified. Response surface methodology data reveal that the effect of pH on the activity of the enzyme is higher than temperature and the calcium effect is less than temperature. Results showed that the optimum condition of AaCel9A activity reaches at pH 6.35 and 64.5 ˚C as well as 4.92 mM of calcium. Finally, the high correlation between experimental and predicted date indicated that the proposed model for optimizing the enzyme activity has a high accuracy.