بررسي اثرات سينتيكي و ترموديناميكي سوربيتول بر روي سودوموناس فلوئورسانس ليپاز

kinetic and thermodynamic properties of pseudomonas fluorescence lipase upon addition of sorbitol

ليپازها به عنوان يك گروه آنزيمي مهم باعث هيدورليز و سنتز استرها مي‌شوند. ليپاز سودوموناس فلوئورسانس يك نوع گرمادوست از ليپازها است كه وزن مولكولي آن در حدود 33 كيلودالتون مي‌باشد. در اين تحقيق اثر غلظت‌هاي مختلف سوربيتول بر روي فعاليت و پايداري كنفورماسيوني سودوموناس فلوئورسانس ليپاز با استفاده از تكنيك‌هاي جذب و دورنگ‌نمايي دوراني مورد ارزيابي قرار گرفت. بر اساس نتايج مطالعات ترموديناميكي غلظت 6/. مولار سوربيتول براي اندازه‌گيري‌هاي سينتيكي بازتاخوردگي و واسرشتگي با استفاده از دستگاه فلوئورسانس جريان متوقف انتخاب شد. نتايج مطالعات سينتيكي نشان داد كه واسرشتگي ليپاز از طريق دو مسير متفاوت صورت مي‌گيرد، يكي از آن‌ها مستلزم واسرشتگي و جدا شدن همزمان زيرواحدها بوده و ديگري دربرگيرنده يك فرآيند دو مرحله‌اي شامل جدا شدن زيرواحدها و به دنبال آن واسرشتگي كامل زيرواحدها مي‌باشد. يافته‌هاي بدست آمده حاكي از آن بود كه در حضور سوربيتول بيشتر جمعيت ملكول‌ها از طريق مسير آهسته دچار واسرشتگي مي‌شوند. نتايج سينتيكي بازتاخوردگي نيز نشان داد كه در حضور سوربيتول سد انرژي واكنش بازتاخوردگي كاهش پيدا مي‌كند.

Lipases, as an important enzyme group, are able to catalyze hydrolysis or synthesis of esters.The lipase from pseudomonas fluorescens (E.C.3.1.1.3) is a thermophilic kind of lipases (MW around 33 Kd). In this study, the effect of different concentrations of sorbitol on the activity and conformational stability of Psedomonas fluorescence lipase was evaluated using UV/Vis and Circular Dichroism (CD), respectively. According to the results of thermodynamic studies the 0.6 M concentration of sorbitol was selected for refolding and unfolding kinetic measurements with stopped flow fluorescence apparatus. Kinetics data indicate that unfolding of lipase is performed via two different pathways; one of them is probably involves a synchronous unfolding and dissociation of subunits and the other one comprises a two step unfolding in which the subunits are first dissociated followed by complete unfolding of subunits. We found that more population of protein molecules unfolded with slow phase unfolding pathway when sorbitol is present in the unfolding buffer. Furthermore; refolding kinetics data suggest that in the presence of sorbitol the energy barrier of refolding is reduced.