ارزيابي روش Real Time در اندازه گيري رايزوپوس اوريزا در رب گوجه فرنگي

Evaluation of Real Time PCR measurement rhizopus oryzae in tomato paste

در اين تحقيق از روش مولكولي Real Time PCR براي اندازه گيري كپك رايزوپوس اوريزا در رب گوجه فرنگي استفاده شد. به دليل مشكلات روش شمارش كپك ها به روش شماره نسبي كپك ها از قبيل احتمال خطاي آزمون كننده، دقت كم و عدم تكرار پذيري، تبيين يك روش استاندارد كه بتواند با دقت و تكرار پذيري بالا تشخيص و شمارش كپك ها را امكان پذير سازد ضروري به نظر مي رسد. روش مولكولي Real Time PCR مي تواند به عنوان يك روش مناسب براي شناسايي و اندازه گيري كمي دقيق كپك ها مطرح باشد كه بر مبناي اندازه گيري مطلق و نسبي ژنهاي كيك هاي موجود ميباشد. نمونه هاي رب گوجه فرنگي با مقادير مختلف اسپور كيك (101، 103 و 105) در هر گرم آلوده شد. پس از گرمخانه گذاري و رشد اسپور پك و ايجاد ميسيليوم استخراج DNA از هر نمونه با استفاده از روش السامرايي انجام شد. سپس با استفاده از واكنش PCR تعداد كپي DNA كپك با استفاده از شناساگر سايبرگرين و پرايمرهاي مربوط به جنس رايزوپوس اوريزا تعيين شد. نتايج نشان داد كه با افزايش مقدار DNA كپك در نمونه هاي شاهد و تلقيح شده منحني Real Time PCR در مقادير Cr كمتري به فاز لگاريتمي وارد مي شوند. ضريب همبستگي خطي منحني استاندارد در آزمون Real Time PCR (0/943=R2 بود كه نشان دهندهي دقت تعيين كمي اين آزمون مي باشد. اختصاصي بودن واكنش با استفاده از منحني ذوب پرايمرها تعيين شد و نشان داد كه واكنش به طور كاملا اختصاصي انجام شده است.

In this study, Molecular method to measure the rhizopus oryzae Real Time PCR was used in tomato paste. Because of problems mold count HMC method such as Proofer error, low and non-repeatability precision, accuracy and repeatability developing a standard method that can enable high accuracy and repeatability and mold counts it seems necessary. Real Time PCR molecular methods can be used as a suitable method to identify and quantify the precise mold is considered that based on the measurement of absolute and relative genes is the existing molds. Tomato paste samples with different amounts of mold spores (101, 103 and 10%) were contaminated per gram. After incubation and growth of mold spores and mycelium extraction DNA from each sample was performed using al-sammari method. Then, using Real Time PCR reaction of DNA copy number of molds using SYBR Green reagent and primers of the rhizopus oryzae genus was determined. The results showed that increasing amount of DNA molds in controls and inoculated samples resulted Real Time curve in the lower Ct values are entered logarithmic phase. The correlation coefficient of linear calibration Real Time was R2=0/943. This indicate that the accuracy of this test is quantitative detection. The reaction specificity was determined using melting curve of the primers and indicated that the reaction has been completely dedicated.