طراحي واكنش زنجيره اي پليمراز براي تشخيص مولكولي هموفيلوس آنفولانزا در نمونه هاي باليني سينوزيت

Polymerase Chain Reaction (PCR) Assay for Molecular Detection of Haemophilus Influenzae Bacterium in Clinical Sample of Sinusitis

سابقه و هدف: هموفيلوس آنفولانزا يك باكتري گرم منفي محدود به انسان است كه بخشي از فلور نازوفارنكس طبيعي در اكثر انسان ها است. هموفيلوس آنفولانزا مي تواند بيماري هايي مانند پنوموني، مننژيت، باكترمي، سينوزيت و اوتيت مياني حاد را ايجاد كند. روش هاي غير كشتي مانند PCR در دسترس در طول دو دهه گذشته بوده اند كه تشخيص سريع و دقيق بيماري هاي باكتريايي را فراهم مي كند. هدف از اين مطالعه طراحي يك آزمايش PCR براي تشخيص سريع باكتري هموفيلوس آنفولانزا است. روش كار: اين مطالعه ژن هدف P6 بود، بنابراين پرايمرهاي مخصوص براي آن طراحي شد. واكنش PCR بر DNA ژنوم هموفيلوس آنفولانزا تنظيم شد. براي ايجاد كنترل مثبت، محصول PCR در pTZ57R/ T كلون شد و به E . coli JM107 انتقال داده شد. حساسيت اين آزمايش با رقت سريالي كنترل مثبت مورد آزمايش قرار گرفت. در مجموع 72 نمونه باليني جمع آوري شده از بيماران مبتلا به سينوزيت با استفاده از PCR مورد تجزيه و تحليل قرار گرفت. يافته ها: نتايج PCR باند مورد انتظار با اندازه 273bp نشان داد. نتايج حساسيت نشان داد كه محدوديت تشخيص اين آزمايش CFU / ml بود. پس از PCR با هيچ يك از ميكروارگانيسم ها مورد آزمايش هيچ تكثيري مشاهده نشد.19 مورد مثبت (26) از هموفيلوس آنفولانزا در نمونه ها در اين مطالعه وجود داشت. نتيجه گيري: روش PCR در اين تحقيق نشان داده شده كه روش سريع، حساس، بسيار اختصاصي و ارزان تر از روش هاي تجاري هستند. روش هاي PCR مي تواند به راحتي توسط آزمايشگاه هاي عمومي كشورهاي در حال توسعه براي اهداف تشخيصي مورد استفاده قرار گيرد.

Background and Objectives Haemophilus influenza is a human-restricted Gram-negative bacterium that is part of the normal nasopharyngeal flora of most humans. H. influenzae can cause diseases such as pneumonia, meningitis, bacteraemia, sinusitis and acute otitis media. Nonculture methods like PCR have become available during the last two decades, providing early and accurate diagnosis of bacterial diseases. The purpose of this study was to design a PCR assay for the rapid detection of H. influenzae bacterium. Materials and methods In this study the target gene was P6 so the specific primers were designed for it. The PCR reaction was set up on the DNA genomic of H. influenzae. To create a positive control, the PCR product was cloned in the pTZ57R/T vector and was transformed into E. coli JM107. The sensitivity of this assay was tested by a serial dilution of the positive control. A total of 72 clinical samples collected from patients with sinusitis were analyzed by PCR. Results PCR results showed a band of the expected size 273 bp. Sensitivity results indicated that the limit of detection of the assay was 1 CFU/ml. No amplification was observed after PCR with any of the microorganisms tested. There was 19 (26%) positive numbers of H. influenza in the samples in this study. Conclusions The PCR method showed to be rapid, sensitive, highly specific, and cheaper than commercial methods. The PCR methods could be easily adopted by public laboratories of developing countries for diagnostic purposes.