اثر ضد بيوفيلم پپتيد مليتين بر سويه هاي استافيلوكوكوس اورئوس توليدكننده بيوفيلم جدا شده از عفونت سوختگي بيمارستاني

Antibiofilm Effect of Melittin on Nosocomial Biofilm Producing Staphylococcus aureus Strains

سابقه و هدف: استافيلوكوكوس اورئوس يك عامل بيماريزاي خطرناك و يك پاتوژن مهم در موسسات درماني و بهداشتي در سطح جهان بوده و از عوامل مهم در ايجاد عفونت سوختگي به شمار مي رود. امروزه تعداد استافيلوكوكوس اورئوس هاي مقاوم به تمام آنتي بيوتيكها رو به افزايش است و به همين دليل پيشنهاد مي شود كه براي درمان عفونت هاي ميكروبي از پپتيدهاي ضد ميكروبي استفاده شود. لذا هدف از اين تحقيق تعيين اثر تخريبي و آنتي باكتريال مليتين استخراج شده از زهر زنبور عسل ايراني بر بيوفيلم توليد شده و سويه هاي بيوفيلم مثبت استافيلوكوكوس اورئوس جدا شده از عفونت سوختگي بيمارستاني شهيد مطهري است. روش كار: در اين مطالعه 50 نمونه استافيلوكوكوس اورئوس از بيمارستان مطهري جمع آوري گرديد و با روش هاي بيوشيميايي و ميكروب شناسي تشخيص داده شد. پپتيد مليتين با تكنيك كروماتوگرافي فاز معكوس ( RP- HPLC ) از زهر آماده شده تخليص و ليوفيليزه شد و سپس غلظت آن با روش بيسينكونينيك اسيد تعيين شد. سويه استان را در محيط SBآبا گلوكز كشت داده و سپس با رنگ كريستال ويوله، بيوفيلم رنگ آميزي گرديد. سپس OD آن را قرائت شد. افزايش OD نسبت به محيط كنترل (TSB بدون گلوكز) نشان دهنده تشكيل بيوفيلم بود. سپس MIC و MBCمليتين بر سويه هاي بيوفيلم مثبت تعيين شد. در مرحله بعد، توانايي تخريب بيوفيلم توسط مليتين در غلظت هاي MIC , 0 . 1MIC , 0 . 01MICبه روش رنگ سنجي بررسي گرديد. در چاهك هاي جداگانه غلظت هاي MIC فوق بكار برده شد و سپس كشت انجام گرديد. يافته ها: حدود 20 پيك در كروماتوگرام HPLC مشاهده شد. بيشترين سطح زير منحني بين فراكشن هاي موجود، مربوط به مليتين بود كه تقريبا 63/8 ٪ از مساحت كل فراكشن ها را به خود اختصاص داده بود. ميانگين كل توليد بيوفيلم برابر با 2/35 بود. با اضافه كردن مليتين ميزان OD كاهش يافت كه اين نتيجه نشان دهنده ي تخريب بيوفيلم باكتري مي باشد. ميانگين كل OD در تمام سويه ها در ( MIC برابر با 1/39 بود. نتيجه گيري: پپتيد مليتين با تكنيك HPLC فاز معكوس با خلوص بالايي تخليص شد. اكثر سويه هاي كلينيكي استافيلوكوكوس اورئوس توليد كننده بيوفيلم بودند. مليتين توانست در مدت كوتاهي در عرض 2 ساعت باعث تخريب بيوفيلم باكتريها گردد. مليتين در دوز MIC قادر به از بين بردن باكتري هاي داخل بيوفيلم مي باشد كه اين مقدار دوز غير سمي محسوب مي شود. مقايسه مطالعات مختلف بين المللي با نتايج اين تحقيق نشان مي دهد كه پپتيد مليتين از لحاظ قدرت مهاري و ميكروب كشي از آنتي بيوتيك هاي ديگر قوي تر بوده ( 14 ، 15 ) و اين موضوع ثابت مي كند كه بررسي بر روي مليتين ارزش تحقيقي و صنعتي زيادي دارد.

Background an‎d Objective Staphylococcus aureus is one of important pathogen in burn infections in many hospitals in the world. Today’s, Multi-drug resistant S. aureus are frequently reported and therefore antimicrobial peptides are suggested to treatment of microbial infections. Accordingly, this study was aimed to purification of melittin from Iranian honey bee venom and evaluation of its activity on biofilm positive S. aureus isolated from Shahid Motahari Burns Hospital. 50 samples of S. aureus were collected from the hospital and diagnosed by routine standard. Materials an‎d Methods Melittin purified by Reverse-Phase HPLC technique, lyophilized, and its peptide content was determined by BCA method. Staphylococcus strains were cultured in TSB glucose medium and the biofilm stained with crystal violet and final OD was documented by a spectrophotometer. Increase of OD comparing to glucose free medium indicates biofilm formation. After that MIC and MBC of biofilm positive strains were determined at the dose of MIC. To confirm the lethality of melittin on the bacteria that was grown in biofilm, the surface of microplate was scratched and a sample was cultured on Muller Hinton agar. The results showed that that melittin was able to kill all of the bacteria in biofilm. Results 20 peaks were seen in chromatogram. The OD average for biofilm production was 2.35 units. The mean OD for the bacteria group that exposed to the dose of one MIC was determined as 1.39. Conclusion The majority of S. aureus strains were biofilm producer that this fact could be very important in terms of treatment strategy. Melittin was able to degrade the produced biofilm during two hours and also killed almost all of the examined bacteria. Comparing the efficiency of melittin with other conventional antibiotics showed that study on development of melittin’s applications is of high value.