بهينه سازي الايزاي مبتني بر آنتي ژن HER2 و مبتني بر سلول براي شناسايي بيوسيميلار تراستوزومب

Optimization of HER2-based and cell-based ELISA for detection of trastuzumab biosimilar

الايزا يك روش حساس، اختصاصي، تكرار پذير و سريع است كه جهت سنجش فعاليت بيولوژيك آنتيبادي ها استفاده مي شود. تراستوزومب يك آنتيبادي مونوكلونال انساني ضد گيرنده ي فاكتور رشد اپيدرمي انساني 2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2, HER2) است كه از شروع مسير پيام رساني پايين دستي جلوگيري ميكند. تراستوزومب ميتواند به عنوان كنترل مثبت در تعيين فعاليت آنتيباديهاي ضد گيرنده HER2 مورد استفاده قرار گيرد. از دلايل محتمل ايجاد پس زمينه در الايزا، شستشو و بلوك كردن ناكافي است كه لازم است بهينه شود. هم چنين، در الايزاي غير مستقيم جهت صرفه جويي در ميزان آنتي ژن، ضروري است حداقل ميزان آنتي ژن كه مي تواند منحني تيتراسيون مناسب تراستوزومب را بدهد، تعيين شود. هدف از اين مطالعه، بهينه سازي روش الايزا براي بيوسيميلار تراستوزومب (آريوتراستTM، شركت آريوژن فارمد) بود. مواد و روش ها در اين مطالعه، متغيرهايي مانند دفعات شستشو، نوع ماده بلوك كننده و غلظت آنتي ژن در الايزاي مبتني بر HER2 و نوع سلول HER2 منفي و ماده ي بلوك كننده در الايزاي مبتني بر سلول بررسي گرديد. يافته ها در الايزاي مبتني بر HER2 مشخص گرديد، شستشوي 5 مرتبه اي بين مراحل مختلف الايزا به صورت معناداري باعث ايجاد پس زمينه كم تري نسبت به شستشوي 3 مرتبه اي مي شود. به علاوه، ميزان اتصال غير اختصاصي در حضور مسدود كننده ي شير خشك 5 درصد به طور معناداري ازBSA 1 و 3 درصد كم تر بود. كم ترين ميزان HER2 كه منجر به ايجاد منحني تيتراسيون مناسب براي آريوتراست شد، غلظت 1/0 ميكروگرم در ميلي ليتر بود. هم چنين، در الايزاي مبتني بر سلول نشان داده شد كه استفاده از رده ي سلولي MDA-MB-231 به عنوان رده ي سلولي HER2 منفي به طور معني داري منجر به كاهش پاسخ پس زمينه در مقايسه با MCF-7 شد. هم چنين، در اين نوع الايزا محلول BSA 3 درصد به عنوان مسدود كننده ي مناسب انتخاب شد. نتيجه گيري داده هاي به دست آمده، ميتواند براي طراحي الايزاي مبتني بر HER2 و مبتني بر سلول آنتيبادي هاي ضد گيرنده HER2 و قطعات آن مورد استفاده قرار گيرد.

ELISA is a sensitive, specific, reproducible and fast method to quantify the biological activity of antibodies. Trastuzumab is a humanized monoclonal antibody against HER2 receptors which prevents the initiation of downstream signaling pathway. Trastuzumab can be used as a positive control in the ELISA experiments for anti-HER2 antibodies. Additionaly, insufficient washing and blocking can be the cause of background in the ELISA experiment that is necessary to be optimized. As we do not want to waste antigen, it is also important to determine the last dilution of antigen that can give good titration curve for trastuzumab. The aim of this study was to optimize ELISA method for trastuzumab biosimilar (AryoTrust™, Aryogen pharmed). Materials and Methods In this study, different variables including the number of washing cycle, the blocking agent and antigen concentration in HER2-based ELISA and the type of HER2 negative cell line and the blocking agent in cell-based ELISA were studied. Results It was demonstrated that 5 times washing between different steps of HER2-based ELISA causes significant lower non-specific background as compared to 3 times washing. Moreover, the nonspecific binding was significantly lower in the presence of % 5 skim milk as blocking agent as compared to BSA %1 or BSA %3. In addition, the lowest HER2 concentration which gives good titration curve for trastuzumab was 0.1 μg/ml. In cell-based ELISA experiment, it was demonstrated that the use of MDA-MB-231 as negative HER2 cell line caused significant lower background than MCF-7. Furthermore, BSA 3% was chosen as proper blocking agent. Conclusion The results of this study can be used for development of HER2 and cell-based ELISA for anti HER2 antibodies and its fragments.