توليد موش ناك اوت Spata19 با استفاده از فناوري CRISPR/Cas9

Generation of global Spata19 knockout mouse using CRISPR/Cas9 nickase technology

ژن SPATA19 در مراحل تكويني بيضه و برخي ارگان ها بيان دارد، ولي تاكنون عملكرد آن فقط در بيضه بررسي شده است. در اين مطالعه با بهره گيري از روش CRISPR/Cas9 nickase ضمن توليد موش ناك اوت Spata19 براي مطالعات بعدي در ساير ارگان ها، مسيري موثر براي توليد اين موش ها ارايه داديم. مواد و روش ها با استفاده از وكتور pX335 و gRNA هاي طراحي شده، پلاسميدهاي CRISPR/Cas9 nickase سنتز شدند. هر كدام از پلاسميدها به باكتري E.coli ترانسفورم شدند و انتخاب كلونال انجام شد. پس از استخراج پلاسميدها از باكتري، به نسبت مساوي با يكديگر تركيب شدند. مخلوط حاصل به پيش هسته ي نر تزريق شد. زيگوت حامل پلاسميد به اويداكت موش فاستر منتقل شد. پس از طي دوران بارداري موش هاي متولد شده مورد آناليز قرار گرفتند. يافته ها با استفاده از روش CRISPR/Cas9 nickase موش هاي ناك اوت با حذف 2 نوكليوتيدي ايجاد كرديم. اين حذف در سه سطح DNA، RNA و پروتيين مورد بررسي قرار گرفت. حذف 2 نوكليوتيدي در سطح DNA و RNA به وسيله توالي يابي تاييد شد. با ترجمه ي توالي RNA جهش يافته مشخص شده كه اين حذف كدون خاتمه زودرس ايجاد مي كند. در بررسي فنوتيپي نيز عقيم بودن موش هاي هموزيگوت نر (Spata19-/-) تاييد شد. نتيجه گيري با توليد موش هاي ناك اوت Spata19 ما يك پروتكل براي توليد موش هاي ناك اوت ارايه مي دهيم. اين موش ها مي تواند به عنوان موش هاي نابارور و براي بررسي ويژگي هاي بيش تر ژن Spata19 به كار گرفته شود.

SPATA19 gene is expressed in developmental stages of testis and some organs, but so far its function has only been examined in the testis. In this study, we provided an effective pathway for the generation of these mice using new CRISPR / Cas9 nickase method while generating Spata19 knockout mice for future studies in other organs. Materials and Methods CRISPR / Cas9 nickase plasmids were synthesized using pX335 vector and designed gRNAs. So, each plasmid was transformed into E.coli and clonal selection was performed. The plasmids extracted from the bacteria were mixed in equal proportions and injected into the male pronucleus. Correspondingly, the zygotes carrying the plasmid were transferred to Oviduct of Foster mice. After pregnancy extent, born mice were analyzed. Results We generated global knockout mice using CRISPR/Cas9 nickase technology. This deletion was examined at three levels of DNA, RNA and protein. Generated 2 nucleotides deletion was confirmed by sequencing at three levels of DNA, RNA and protein. By translating the mutated RNA sequence, it was determined that this deletion could cause premature stop codon. Phenotypic analysis confirmed infertility of male homozygous mice (Spata19 -/-). Conclusion By generating Spata19 knockout mice, we present a protocol for generation of knockout mice. These mice could be applied as the infertile male mice and also for further characterization of Spata19 gene.