به كارگيري روش سريع و حساس Real time PCR در تشخيص ناخالصي هاي DNA در اينترفرون نوتركيب

Application of Rapid and Sensitive Real Time PCR Technique in Detection of DNA Impurities in Recombinant Interferon

چكيده: (10838 مشاهده) زمينه و هدف: اينترفرون‌ها خانواده‌اي از سايتوكاين‌ها هستند كه در پاسخ ايمني به عفونت‌هاي ويروسي نقش اساسي دارند. در جريان توليد اينترفرون نوتركيب در ميزبان بيولوژيك، قطعاتي از اسيدنوكلئيك ميزبان وارد محصول مي‌شود. به علت وجود محدوديت‌هاي روش‌هاي قبلي در تشخيص اين آلودگي‌ها، هدف از اين مطالعه، استفاده از روش مولكولي سريع و حساس Real time PCR در اين ناخالصي‌ها مي‌باشد. مواد و روش‌ها: ابتدا با استخراج DNA از ميزبان باكتريايي و تهيه رقت‌هاي متوالي از آن، واكنش Real time PCR به كمك رنگ SYBR Green I انجام گرفت و منحني استاندارد رسم گرديد. پس از استخراج DNA از اينترفرون و انجام واكنش PCR، ميزان DNA به كمك منحني استاندارد، تعيين گرديد. نتايج: بررسي‌هاي انجام شده بر روي چند نمونه اينترفرون، ميزان آلودگي DNA را حدود 02/0 پيكوگرم در هر دوز محصول نشان داد. همچنين پرايمرهاي طراحي شده در واكنش فوق، هيچ گونه واكنشي با يكديگر و ساير عوامل مداخله كننده نشان ندادند. نتيجه‌گيري: مطالعه فوق براي اولين بار در ايران بهينه سازي شد و نشان داد كه تكنيك Real time PCR مي‌تواند به عنوان يك روش كاربردي و بسيار دقيق در مراكز توليدي جهت تشخيص ناخالصي‌هاي DNA ناشي از ميزبان، در اينترفرون و ساير محصولات دارويي نوتركيب به كار برده شود.

Background & Objective: Interferon belongs to a family of cytokines, which has the most important role in the innate immune response to virus infections. While producing recombinant interferon in biological host, some pieces of host nucleic acids remain in product. Because of limitations in previous techniques for detection of these impurities, the objective of this study is to use rapid and sensitive Real time PCR method for detecting the impurities. Materials & Methods: First, with DNA extraction from bacterial host cell and preparation of its serial dilutions, SYBR Green-based Real time PCR reaction was held and standard curve was plotted. After DNA extraction from interferon and performing PCR, total DNA amount was determined using standard curve. Results: Studies performed on some interferon samples, revealed that the amount of DNA impurities was about 0.02 pg. per product dose. In addition, the designed primers in the above reaction had no interaction with each other and other interfering agents. Conclusion: For the first time in Iran, this study was set up and it revealed that Real time PCR can be used as a functional and accurate technique in manufacture centers for detection of residual host cell DNA in interferon and other recombinant pharmaceutical products.