رديابي و معرفي نشانگرهاي ريزماهواره مرتبط با مسير بيوسنتز استويول گليكوزيدها در گياه استويا از طريق بازآرايي ترنسكريپتوم از نو

Development of SSR Markers Associated with Biosynthesis Pathway of Steviol Glycosides in Stevia through De Novo Transcriptome Assembly

هدف عمده برنامه هاي بهنژادي استويا (Stevia rebaudiana) ايجاد گياهاني با ميزان ريبوديوزيد-آ (RA) بالا مي باشد. در اين راستا، به منظور غربالگري گياهان استويا و انتخاب واريته هايي با بيشترين ميزان شيرين كننده هاي موردنظر با استفاده از نشانگرهاي مولكولي، تحقيق حاضر بر روي داده هاي RNA-seq واريته هاي داراي مقادير مختلف RA انجام گرديد. به منظور بازآرايي ترنسكريپتوم از نو براي هر واريته، از نرم افزار CLC با درنظرگرفتن طول k-mer برابر با 20 و حداقل طول كانتيگ برابر با 200 جفت باز استفاده شد. به منظور انجام تفسير، آخرين نسخه از پروتيوم گياه مدل ارابيدوپسيس بكار برده شد. براي شناسايي SSRهاي چندشكل كانديد در ميان واريته هاي استويا، با استفاده از CandiSSR آناليز توالي هاي بازآرايي شده و بدنيال آن طراحي جفت آغازگرهاي مربوطه صورت گرفت. حدود 368 نشانگر SSR بالقوه شناسايي گرديد كه در اين ميان 360 نشانگر شرايط لازم براي طراحي آغازگر را دارا بودند. تقريبا 89% از كانتيگ هاي واجد SSRهاي چندشكل داراي بهترين توالي مشابه در برابر پروتيوم ارابيدوپسيس بودند. در اين مطالعه، كانتيگ هاي مشابه با خانواده پروتييني UDP-Glycosyltransferase و Deoxyxylulose-5-phosphate synthase كه در مسير بيوسنتز استويول گليكوزيدها دخيل مي باشند شناسايي گرديد. همچنين آناليز gene set enrichment با استفاده از PlantGSE از طريق آزمون Hypergeometric درسطح معني داري (FDR < 0.05) چندين مسير متابوليكي مرتبط با توالي هاي حاوي SSRهاي چندشكل را مورد شناسايي قرار داد. بنابراين، مي توان اين فرضيه را مطرح نمود كه نشانگرهاي SSR چندشكل توسعه يافته در اين تحقيق با اطمينان در برنامه هاي بهنژادي مولكولي استويا به منظور انتخاب واريته هاي با ميزان بالاي SG به ويژه RA قابل استفاده مي باشند.

In stevia (Stevia rebaudiana), breeding programs are mainly aimed at developing plants with high Rebaudioside-A (RA) content. To this end, in order to screen stevia plants and selection of varieties with the highest amount of desired sweeteners (RA) using molecular markers, the present study was conducted on RNA-seq data of varieties having different amounts of RA. In order to de novo transcriptome assembly for each variety CLC was used considering k-mer and contig length values of 20 and at least 200bp, respectively. The assembly was annotated using the latest Arabidopsis proteome release. To identify signatures of candidate polymorphic SSRs among the stevia varieties, the assembled sequences were used as an input for CandiSSR, followed by designing primer pairs for identified polymorphic SSRs. 368 potential polymorphic SSRs were identified based on the stevia transcriptome analysis, among which 360 were qualified for primer design. Almost 89% of the contig sequences possessing polymorphic SSRs had the best blast hit against Arabidopsis proteome. In this study, contigs similar to the UDP-Glycosyltransferase protein family and Deoxyxylulose-5-phosphate synthase which are involved in the biosynthesis pathway of steviol glycosides were found. Also, gene set enrichment analysis using PlantGSE through hypergeometric test (FDR<0.05) identified enriched metabolic pathways in the sequences contained polymorphic SSRs. It is, therefore, most likely that such connections exist between the SSRs and biosynthesis of steviol glycosides. Hence, it could conceivably be hypothesized that the SSR markers developed in this study would be reliable in molecular breeding of stevia toward selection of varieties with high content particularly RA.