جداسازي، خالص سازي و تعيين ويژگي هاي بيوشيميايي آنزيم كاتكول 1و 2 دي اكسيژناز از فلور ميكروبي خاك هاي آلوده نفتي

Isolation, Purification, and Determination of Biochemical Properties of Catechol 1, 2 Dioxygenase from Microbial Flora in Petroleum-Contaminated Soils

پژوهش حاضر با هدف خالص سازي و شناسايي بيوشيميايي آنزيم تجزيه كننده فنول از باكتري هاي موجود در خاك هاي حاوي آلاينده هاي نفتي انجام پذيرفت. پروتيين كاتكول 1و 2 دي اكسيژناز از باكتريAneurinibacillus migulanus Isolate ZNU05 استخراج و با استفاده از ستون كروماتوگرافي تبادل يوني Q-Sepharose تخليص شد. فعاليت آنزيم در pH هاي مختلف بين 4 تا 9، محدوده دمايي 20 تا 70 درجه سلسيوس، و در حضور نمك كلريد يون هاي فلزي مختلفي مانند 2+ Ca، K+، Mn2+،Co2+ ،Zn 2+،Mg2+ ، Cu2+، + Na و حلال هاي گوناگون شامل اتانول، اتيل استات، پتروليوم اتر، استونيتريل، ان-آميل الكل، ان-هگزان و تولوين ارزيابي شد. همچنين فعاليت اين آنزيم با استفاده از سوبستراهاي گوناگون مانند فنول، كتكول، بنزوييك اسيد، پيروگالول و آلفا نفتول بررسي گرديد. آناليز پروتيين به روش SDS-PAGE بيانگر وجود تك باند پروتييني با وزن مولكولي حدود 40 كيلودالتون بود. نتايج تعيين ويژگي آنزيم كتكول 1و2 دي اكسيژناز نشان داد كه pH و دماي مطلوب به ترتيب 5/8 و 30 درجه سلسيوس بود. فعاليت كاتاليتيكي آنزيم در حضور يون هاي كلريد كبالت و روي (5 ميلي مولار) و همچنين حلال آلي آميل الكل، افزايش يافت، ولي ديگر يون هاي فلزي و حلال هاي آلي بكار رفته باعث كاهش و يا مهار فعاليت آنزيم شدند. از ميان سوبستراهاي مختلف بر روي فعاليت آنزيم، كتكول سوبستراي بسيار مطلوب تري براي آنزيم بود، به طوري كهVmax و Km آنزيم براي اين سوبسترا به ترتيب 959/8 واحد بر ميلي گرم و 4/992 ميكرومول بر ميلي ليتر مي باشد.

The present study was accomplished to isolate, purify, and biochemically characterize the phenol-degrading enzyme from the bacteria existed in petroleum-contaminated soils. The catechol 1, 2 dioxygenase was extracted from Aneurinibacillus migulanus Isolate ZNU05 and purified using Q-Sepharose ion exchange chromatography column. The enzyme activity was examined under different pHs (ranged from 4 to 9), at different temperatures (ranged from 20 to 70°C), in the presence of various metal ions chloride salts (Ca2+, K+, Mn2+, Co2+, Zn2+, Mg2+, Cu2+ and Na+), and with various solvents (ethanol, ethyl acetate, petroleum ether, acetonitrile, N-amyl alcohol, N-hexane, and toluene). In addition, the enzyme activity was investigated using different substrates such as phenol, catechol, benzoic acid, pyrogallol, and α-naphtol. SDS-PAGE analysis indicated that there was a single-band protein with a molecular weight of approximately 40kDa. The catechol 1, 2 dioxygenase had a maximum activity at 30°C and pH= 8.5. Moreover, the catalytic activity of the enzyme was increased in the presence of cobalt chloride and zinc chloride ions (5mM) as well as organic solvent of amyl alcohol, while it was decreased or inhibited in the presence of the other metal ions and organic solvents used. Among different substrates, catechol was the most favorable for the enzyme, so that, the Vmax and Km were 8.959U/mg and 4.992μm/ml for the substrate, respectively.