كلونينگ و بيان ژن كدكننده ي نواحي آنتي ژني پروتئين غيرساختاري 3D ويروس بيماري تب برفكي

Cloning and Expression of the Gene Encoding Antigenic Regions of 3D Non-Structural Protein of Foot-and-Mouth Disease Virus

تب برفكي (FMD) بيماري بسيار واگيردار و ويرانگر است كه به سرعت انتشار مي يابد و خسارات اقتصادي زيادي را موجب مي شود. يكي از روش هاي مهم تشخيص بيماري و خصوصا تفكيك حيوان واكسينه شده از حيوان مبتلا به اين بيماري، استفاده از پروتيين هاي غيرساختاري بعنوان آنتي ژن در كيت هاي تشخيصي الايزا مي باشد. هدف از مطالعه ي حاضر، كلونينگ توالي ژني و بيان نواحي آنتي ژني پروتيين غير ساختاري 3D به عنوان يكي از گزينه هاي تشخيصي مي باشد. براي تكثير ژن كدكننده ي نواحي آنتي ژني پروتيين 3D ويروس تب برفكي، آغازگرهاي اختصاصي داراي جايگاه برشي آنزيم هاي NdeI و EcoRI طراحي شد و واكنش زنجيره اي پليمراز انجام شد. ژن برش خورده توسط اين دو آنزيم، به ناقل PET21a+ انتقال داده شد و در باكتري هاي اشرشياكلي DH5α ترنسفورم شد. آزمايشات كلوني -PCR و برش آنزيمي بر روي كلوني هاي حاصل انجام و حضور ژن هدف تاييد شد. توالي ژني نيز پس از توالي يابي تاييد شد. براي توليد آنتي ژن نوتركيب، وكتور بياني نوتركيب به ميزبان بياني باكتري اشريشاكلي BL21 انتقال داده شد. باكتري هاي حاوي ژن نوتركيب، با IPTG القا شدند و بيان پروتيين نوتركيب با استفاده از روش SDS PAGE تاييد شد. وزن مولكولي پروتيين نوتركيب موردنظر حدود 24 كيلودالتون بوده و از آن ميتوان در طراحي كيت تشخيصي الايزا استفاده كرد

Foot-and-Mouth Disease (FMD) is a highly contagious and devastating disease that spreads rapidly and causes many economic damages. One of the important methods for the detection of FMD and particularly differentiation of vaccinated from infected animals, is the use of nonstructural proteins as antigens in ELISA kits. The purpose of the present study was cloning the gene sequence and expression of the antigenic regions of 3D nonstructural protein as one of the diagnostic options. For amplification of the antigenic regions of FMD virus 3D protein, specific primers containing NdeI and EcoRI restriction sites were designed and the polymerase chain reaction was performed. The sequence cut by these two enzymes were inserted into pET21a+ vectors. The recombinant plasmids were then transformed into E. coli (DH5α). Colony-PCR tests and enzymatic digestions were performed on the resulting colonies and the presence of the target gene was confirmed. The gene sequence was further confirmed after sequencing. For the production of recombinant antigens, the recombinant vector was transferred to the expression host of E. coli BL21. The bacteria containing the recombinant gene were induced with IPTG and the expression of the recombinant protein was confirmed using the SDS-PAGE method. The molecular weight of the recombinant protein was about 24kDa, and it can be used in the design of ELISA diagnostic kit.