كلون سازي و بيان ژن بتا( 1-3 )(1-4)گلوكاناز در باكتري اشيرشياكلي جهت توليد مكمل خوراك دام

cloning and Expression of β (1-3)(1-4) glucanase gene in E.coli for production as animal feed supplement

بتاگلوكان هموپليمر خطي از واحد هاي دي گلوكز است كه با پيوندهاي بتاگليكوزيدي به يكديگر متصل شده اند. اين تركيب يكي از اجزاء اصلي تشكيل دهنده غلاتي مانند جو، يولاف و گندم است. آنزيم‌هاي بتاگلوكاناز اين پليمر را با شكستن اتصالات بتاگليكوزيدي، به اجزاء سازنده آن تجزيه مي كنند. هدف از اين مطالعه بيان ژن ليكيناز در باكتري و توليد آنزيم نو تركيب به عنوان مكمل غذايي براي طيور است. اين امر امكان جايگزيني جو بجاي ذرت در جيره غذايي طيور را فراهم مي‌سازد. در اين تحقيق ژن كدكننده آنزيم بتا1و3 – 1و4گلوكاناز باكتري گرمادوست Clostridium thermocellum در وكتور بياني pET22b(+) و باكتري E.Coli سويه BL21 كلون گرديد. بيان ژن آنزيم بتاگلوكاناز در باكتري بيانيBL21 پس از القاي بيان توسط (IPTG 0.1 mM) بااستفاده از تكنيك SDS-PAGE مورد تاييد گرفت. همچنين به منظور سنجش ميزان فعاليت آنزيمي پروتئين نوتركيب از تست كاهش قند و بررسي ميزان هضم گلوكان جو استفاده گرديد. جهت تاييد شرايط بهينه به منظور توليد پروتئين نوتركيب، تيمار‌هاي مختلف دما، زمان و pH بر محيط رشد باكتري مورد بررسي قرار گرفت. نتايج نشان داد كه دماي بهينه فعاليت آنزيم 55 درجه سانتي‌گراد است و حداكثر فعاليت آنزيمي در مدت زمان4 ساعت پس از القا و pH=8 بدست آمد. استفاده از جو درجيره غذايي طيور معمولا مقرون به صرفه است. اما وجود مقادير قابل توجهي از بتاگلوكان‌ها درجو به كارگيري اين دانه را با مشكل مواجه ساخته است. توليد و تاييد اثر اين آنزيم بر هضم گلوكان جو استفاده آن را در تهيه‌ي غذاي طيور ممكن مي‌سازد.

β-Glucans (beta-glucans) form a natural component of the cell walls of bacteria, fungi, yeast, and cereals such as oat and barley. Glucanases are enzymes that break down a glucan. β-glucans are chains of D-glucose polysaccharides linked by β-type glycosidic bonds. The purpose of this study is to express the lechinase enzyme in bacteria to produce recombinant enzyme as a feed supplement in poultry diets. In this study, LicBM2 gene, isolated from Clostridium thermocellum, encodes thermostable lichenase enzyme was cloned in expression vector pET22b (+) and E.Coli bacteria strain BL21. Bacterial β-1,3–1,4-glucanases (EC 3.2.1.73; lichenase) specifically cleave the β-1,4-glycosidic linkage adjacent to 3-O-substituted glucopyranose residues. Gene expression was confirmed using SDS-PAGE techniques. Enzyme activity of recombinant protein and reducing glucan in barly were measured by DNS method. The optimum temperature for recombinant protein production was 55 ° C and the maximum enzyme activity was obtain within 4 hours after inducing in pH = 8. Using barlay in poultry diet is more economical. But the significant amounts of beta-glucans in barlay cause more problems. The recombinant enzyme produced in this study can be used as a feed supplement for hydrolyzation of barley β-glucan to replace of corn by barley in poultry diets.