افزايش تحمل به علف كش گلايفوسيت در نتيجه بيان ژن نوتركيب گلايفوسيت اكسيدورداكتاز (gox) در باكتري اشرشيا كولي

Increasing tolerance to glyphosate herbicide in Escherichia coli by expression of recombinant glyphosate oxidoreductase (gox) gene

متحمل‌سازي گياهان زراعي نسبت به علف‌كش گلايفوسيت از طريق دست‌ورزي‌هاي ژنتيكي يكي از كاراترين روش‌هاي موجود در مديريت علف‌هاي هرز محسوب مي‌شود. راه حل مطلوب براي توسعه گياهان متحمل در سطح تجاري، به كارگيري ژن‌هاي عامل آنزيم هاي تجزيه كننده گلايفوسيت نظير گلايفوسيت اكسيدورداكتاز در كنار EPSPS مقاوم به گليفوسيت مي‌باشد. ژن گلايفوسيت اكسيدورداكتاز اولين بار از باكتري Ochrobactrum antrophi سويه LBAA جدا گرديده كه آنزيم آن، علف‌كش گلايفوسيت را به آمينومتيل فسفونيك اسيد و گلي‌اكسالات تبديل مي‌كند. در تحقيق حاضر، براي مطالعه كارايي گلايفوسيت اكسيدورداكتاز، توالي ژن آن سنتز و در ناقل بياني pET28a همسانه سازي گرديد. پس از انتقال به باكتري اشرشياكلي، بيان پروتئين هدف با روش SDS-PAGE مورد تائيد قرار گرفت. آزمايشات بهينه سازي بيان ژن در باكتري نشان داد كه شرايط بهينه شامل دماي 37 درجه سانتيگراد براي كشت، 4 ساعت پس از القا با IPTG يك ميلي‌مولار در OD600=0.6 مي‌باشد. در مرحله بعد، به منظور انجام آزمون زيستي باكتري‌هاي تراريخت، حد آستانه تحمل باكتري‌هاي شاهد در محيط حداقل فاقد فسفات با غلظت‌هاي مختلف گلايفوسيت انجام و با باكتري‌هاي نوتركيب مقايسه گرديد. نتايج نشان داد كه باكتري‌هاي شاهد غلظت بيشتر از 5/0 ميلي‌مولار گلايفوسيت را نمي‌توانند تحمل كنند؛ در صورتي كه باكتري‌هاي نوتركيب تا غلظت 1 ميلي‌مولار زنده مي‌مانند. اين نتايج با انجام روش شمارش كلوني و پس از سه تكرار تاييد گرديد. بنابراين ژن گلايفوسيت اكسيدورداكتاز مي‌تواند كانديد مناسبي در كنار ساير ژن‌هاي عامل مقاومت به گلايفوسيت جهت دست‌ورزي ژنتيكي گياهان استراتژيك با هدف بدست آوردن سطوح بالاتر و پايدارتر مقاومت به اين علف‌كش باشد.

Genetic manipulation of crop plants to obtain resistance to herbicide glyphosate is one of the most effective approaches for weed management. Application of the genes encoding glyphosate degrading enzymes such as glyphosate oxidoreductase (GOX) in combination with a glyphosate-tolerant EPSPS is the ultimate approach to provide commercial rates of glyphosate tolerance. The gox gene was first isolated from Ochrobactrum antrophi strain LBAA that catalyses the cleavage of glyphosate into aminomethylphosphonic acid and glyoxalate. In this study, the gox gene was synthesized and cloned in pET28a expression vector and transformed in E. coli. The expression of the target protein was confirmed by SDS-PAGE. The experiment for optimization of gene expression showed that the optimal condition was 37oC for bacterial culture, 4 hours of induction time using 1 mM IPTG in OD600=0.6. In the next step, in order to perform a bioassay on transformed bacteria, the threshold of tolerance of control bacteria in minimum phosphate-free medium with different concentrations of glyphosate was investigated and compared with recombinant bacteria. The result indicated that the wild type bacteria were not able to tolerate concentration of more than 0.5 mM glyphosate but the recombinant bacteria survived to a concentration of 1 mM. These results were confirmed by colony counting on selective media with three repetitions. Hence, glyphosate oxidoreductase gene could be a suitable candidate besides the other glyphosate resistance genes for genetic manipulation of strategic plants with the aim of obtaining higher and more sustainable levels of resistance to this herbicide.