بهينه‌سازي روش‌هاي مولكولي شناسايي نماتد عامل ريشه‌گره‌اي (Meloidogyne javanica)

به منظور شناسايي سريع مراحل مختلف رشدي گونه Meloidogyne javanica كه در ايران به عنوان يكي از خسارتزاترين نماتدهاي گياهي شناخته شده، تعداد 40 نمونه خاك و ريشه آلوده به نماتد ريشه‌گره‌اي از نقاط مختلف جاليزكاري استان فارس (داراب، جنت شهر، استهبان، نورآباد، كوار و شيراز) جمع‌آوري گرديد. پس از خالص‌سازي به روش تك كيسه تخم روي ريشه گوجه فرنگي رقم Rutgers و شناسايي گونه M. javanica بر اساس ويژگي‌هاي ريخت‌شناسي (مورفولوژي) و ريخت‌سنجي ماده‌هاي بالغ و لارو سن دوم، DNA ژنومي كليه مراحل رشدي از مرحله تخم، لارو سن دوم و ماده‌هاي بالغ نماتد، به سه روش ژانگ، سيلوا و ليوآ استخراج شد. DNA استخراج شده با كمك جفت آغازگرهاي اختصاصي گونه Fjav/Rjav, MjMF/MjMR, MjDF/MjDR  تكثير گرديد. در كليه مراحل رشدي گونه M. javanica يك قطعه 1650 جفت بازي توسط جفت آغازگر MjDF/MjDR ، يك قطعه 517 جفت بازي توسط جفت آغازگر MjMF/MjMR و يك قطعه 670 جفت بازي توسط جفت آغازگر Fjav/Rjav تكثير شد ولي اين قطعات با جفت آغازگر MIF و MIR، مربوط به نماتد M. incognita و آب كه به عنوان كنترل منفي در آزمايش استفاده شده بودند تكثير نشدند. لذا به نظر مي‌رسد كاربرد اين جفت آغازگرها در قياس با خصوصيات ريخت‌شناسي در مراحل مختلف رشدي نماتد به تشخيص سريع تر گونه M. javanica منجر مي‌شود. در بهينه‌سازي PCR براي تشخيص نماتد M. javanica بهترين دما براي آغازگرهاي MjMF و MjMR، 56 درجه سانتي‌گراد براي MjDF و MjDR، 50 درجه سانتي‌گراد و براي Fjav و Rjav، 54 درجه سانتي‌گراد تعيين گرديد، ميزان DNA الگو حاصل از روش‌هاي مختلف استخراج در آزمون PCR در خصوص ماده كامل و كيسه تخم از يك ميكروليتر به دو ميكروليتر و لارو سن دوم از دو ميكرو ليتر به چهار ميكروليتر بهترين نتيجه حاصل شد. در خصوص MgCl2 با افزايش ميزان آن از 1.5 ميلي‌مولار به 2 ميلي‌مولار در واكنش 25 ميكروليتري PCR بهترين نتيجه حاصل گرديد. بهترين روش استخراج كه قادر به رديابي تك لارو سن دوم نماتد بود روش ليوآ در نظر گرفته شد. بهترين آغازگرها كه قادر به رديابي نماتد  M. javanicaدر تمام مراحل رشدي بودند، جفت آغازگرMjMF/MjMR و Fjav/Rjav بودند.