بهينه‌سازي بيان پروتئين اينترلوكين-5 در باكتري Escherichia Coli سويه‌ي BL21

Optimization of Interleukin-5 Protein Expression in BL21 Strain of Escherichia Coli

مقدمه: در آسم، رابطه‌ي بين تعداد ائوزينوفيل‌ها و شدت بيماري، اين فرضيه را تقويت مي‌كند كه ائوزينوفيل، سلول مؤثر اصلي در التهاب راه‌هاي هوايي است. تكامل ائوزينوفيل به طور عمده با اينترلوكين-5 تنظيم مي‌شود. بنابراين، با ممانعت از عملكرد اينترلوكين- 5 (IL-5)، مي‌توان حداقل يكي از دلايل ايجاد آسم را سركوب كرد. براي توليد آنتاگونيست‌هايي مثل آپتامر ضد اينترلوكين-5، لازم است اين پروتئين به مقدار زياد و با خلوص بالا بيان گردد. مطالعه‌ي حاضر با هدف تهيه‌ي اپتامر ضد IL-5 به جاي آنتي‌بادي جهت استفاده در درمان بيماري‌هاي ائوزينوفيليك و بيان اين پروتئين در يك سيستم پروكاريوتي انجام شد. روش‌ها: ابتدا سازه‌ي حاوي complementary DNA (cDNA) ژن پروتئين اينترلوكين-5 طراحي و سفارش ساخت در وكتور pET28a داده شد. وكتور بياني به باكتري‌هاي مستعد شده‌ي Escherichia coli BL21 (DE3) تبديل شد. سپس، بيان پروتئين با تغيير شرايط دما و زمان انكوباسيون و ميزان Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) بهينه گرديد. ارزيابي بيان پروتئين با به كار گيري روش‌هاي Western blot و Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) و در مراحل مختلف صورت گرفت. يافته‌ها: شرايط بهينه براي بيان پروتئين اينترلوكين-5، غلظتي از باكتري كه در طول موج 600 نانومتر جذب بين 8/0-6/0 داشت، غلظت نهايي 1 ميلي‌مولار براي IPTG، 18 ساعت انكوباسيون در دماي 29 درجه‌ي سانتي‌گراد و شتاب 150 دور/دقيقه بود. باند 13 كيلودالتوني روي ژل پلي‌آكريل‌آميد در SDS-PAGE و غشاي نيتروسلولزي در روش Western blot تأييد كننده‌ي بيان پروتئين اينترلوكين-5 بود. نتيجه‌گيري: از اين پروتئين، در فرايندهايي چون تهيه‌ي آپتامر بر عليه IL-5 و كيت‌هاي Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)ي مخصوص اندازه‌گيري IL-5 مي‌توان استفاده نمود. در اين فرايندها، به آنتي‌ژن با فولدينگ بسيار صحيح نياز نمي‌باشد. بنابراين، بيان در سيستم پروكايوتي به علت بازده بالا انجام شد.

Background: In asthma, the relationship between number of eosinophils and severity of this disease supports the hypothesis that eosinophil is the major effector cell in inflammation of airway. Evolution of eosinophils is regulated by interlukin-5 (IL-5). Therefore, by blocking IL-5, at least one major reason of asthma would be prevented. To produce antagonists against IL-5 (like aptamer), it is necessary to have this protein in large scale and high purity. This study aimed to optimize IL-5 protein expression of BL21 strain of Escherichia coli (E. coli) to be used instead of antibody. Methods: At first, complementary DNA (cDNA) construct encoding IL-5 was designed, and was ordered to be produced in pET28a vector. Expression vector was transformed into competent E. coli Bl21 (DE3) origami. Then, protein expression was optimized by altering temperature, incubation time, and the amount of isopropyl βd-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Protein expression was assessed using sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and western blot in different levels of the test. Findings: The optimum conditions for protein expression were gained when the density of bacteria at the OD600 reached to 0.6 to 0.8, and culturing was done at 29 °C for 18 hours and 150 rpm, andinduction with 1mM IPTG. There was a 13-kDa protein band on SDS-PAGE and western blot that confirmed the expression of IL-5 protein. Conclusion: This protein can be used for producing aptamers against IL-5 and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit for measuring IL-5. In all these process, there is no need to perfect folding of the protein. Therefore, the expression can be done in prokaryotic system, as it has high efficiency. Key words: Gene expression; Interleukin-5; Prokaryotic cells; Escherichia coli