اثر سايتوتوكسيك فراگاسياتوكسين C نوتركيب روي سلول هاي تك هسته اي خون محيطي

Cytotoxic Effect of Recombinant Fragaceatoxin C on Peripheral Blood Mononuclear Cells

زمينه و هدف اكتينوپورين ها پروتيين ها و پپتيدهاي سيتوليتك هستند كه توسط شقايق دريايي توليد مي شوند و باعث تشكيل منفذ در غشاي ليپيدي مي شوند. فراگاسياتوكسين C يكي از اعضاي اين خانواده با وزن مولكولي 20 كيلودالتون مي باشد كه به طور خاص به اسفنگوميلين در غشاي پلاسمايي متصل و منافذ كاتيوني انتخابي به قطر دو نانومتر را در غشا تشكيل مي دهد. هدف اصلي از اين مطالعه بررسي فعاليت زيستي سم روي سلول هاي تك هسته اي خون محيطي(PBMCs) مي باشد. مواد و روش ها وكتور بياني pET28a دربرگيرنده توالي كد كننده FraC به سلول مستعد اشرشيا كلي سويه BL21 ترانسفورم گرديد. سپس تخليص پروتيين بوسيله كروماتوگرافي تمايلي انجام شد. تخليص پروتيين توسط الكتروفورز ژل پلي آكريل آميد تاييد شد. غلظت هاي مختلف از سم روي سلول هاي قرمز خون (RBC) تست شد و فعاليت هموليزي آن، با ثبت در طول موج 700 نانومتر آناليز شد. به منظور بررسي فعاليت ضدسلولي سم تخليص شده، PBMCs با استفاده ازغلظت هاي متفاوت سم مورد تيمار قرار گرفتند. فعاليت سيتوليتيك پروتيين FraC روي سلول هاي تك هسته اي خون محيطي با استفاده از روش) دي متيل تيازول- دي فنيل تترازوليوم برومايد(MTT و نوترال رد سنجيده شد. نتايج ارزيابي فعاليت هموليتيك نشان داد سم در تمام مراحل تخليص فعاليت خود را حفظ مي كند. نتايج بررسي فعاليت سيتوليتيك روي PBMCs نشان مي دهد در غلظت هاي پايينFraC ، نسبت زنده ماني سلولها به گروه شاهد تغيير معني داري نيافته است. فعاليت متابوليكي PBMCs فقط در غلظت هاي بالاتر توكسين (800 و 1000 نانومولار) به طور قابل توجهي كاهش يافت. با توجه به نتايج تست تريپان بلو، داده هاي حاصل از روش نوترال رد نشان داد با افزايش غلظت سم، سنجش جذب نوترال رد در PBMCs به طور قابل توجهي كاهش مي يابد. نتيجه گيري با وجود فعاليت ضد سلولي سم رويRBC ،FraC در غلظت هاي پايين داراي فعاليت سايتوتوكسيك روي سلولهاي تك هسته اي خون محيطي نمي باشد.

Background & Objective: Actinoporins from sea anemones are potent pore-forming toxins. Fragaceatoxin C belongs to this family with a molecular weight of 20 kDa that mainly binds sphingomyelin in membranes and forming 2nm in diameter cation-selective pore. The aim of this study was the examination of recombinant toxin activity against peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Material & Methods: For recombinant expression of toxin, E.coli Bl21 was employed. The toxin purified by Ni2+-NTA Sepharose affinity chromatography. The purity of toxin was confirmed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis ) SDS-PAGE(. Various dilutions of the toxin were applied on red blood cells, and their hemolytic activity was analyzed by spectrophotometer by recording OD700. To examine the cytotoxic activity of purified toxin, PBMCs were treated with its different concentration. Cytolytic activity of FraC protein on PBMCs was measured using MTT and neutral red uptake assays. Results: Hemolytic assessment indicated that the toxin had retained its activity after purification. Analysis of PBMCs tests showed that low doses of toxin did not change the viability of cells compared to control cells. The metabolic activity of living PBMCs was only significantly decreased at the higher concentration (800 and 1000 NM) of the toxin. Despite the results of trypan blue tests, obtained data indicated that the Neutral red uptake assay was significantly reduced in PBMCs in a dose-dependent manner. Conclusion: Despite toxicity against RBCs, FraC is not toxic to the peripheral blood mononuclear cells at lower doses.