توليد رده سلولي ناك اوت IDUA توسط تكنيك ويرايش ژني CRISPR/Cas

مقدمه: موكوپلي ساكاريدوز تيپ (MPSI) I بيماري شايع ذخيره اي ليزوزومي است كه به واسطه كمبود آنزيم آلفاال - ايدورونيداز (IDUA) بر روي كروموزوم 4 (4p16.3) ايجاد مي گردد. اين آنزيم در تجزيه گليكوزآمينوگليكانها يا موكوپلي ساكاريدهاي درماتان سولفات و هپاران سولفات دخالت دارد و نقص در آنزيم مذكور منجر به افزايش سطح گليكوز آمينو گليكان ها (GAG) در خون و تجمع آن در اعضاي مختلف بدن مي شود. اين تركيبات پروتئوگليكاني زيربناي ساختاري ماتريكس خارج سلولي و ساختار غضروفي نقاطي مثل مفاصل، دريچه هاي قلبي را فراهم مي نمايد؛ بعلاوه در تنظيم ارتباطات سلولي نقش دارد. در اين مطالعه ما سيستم CRISPR/Cas را طراحي كرديم كه ژن كد كننده انزيم IDUA را مورد هدف قرار داده است و ما توانستيم سلوهاي ناك اوت اين ژن را توليد كنيم. مواد و روش ها: ابتدا sgRNA هدف IUDA در پلاسميد px335 كلون شد، با استفاده از نقشه برداري محدودكننده، پلاسميد نوتركيب تأييد شد. سپس پلاسميد نوتركيب به رده سلولي اپيتليال انساني، HEK293 ترانسفكت شد. كلون هاي جهش يافته توسط آناليز melting غربالگري شدند و جهش آنها با تعيين توالي سنگر مشخص شد. يافته ها: هضم آنزيمي و تعيين توالي سنگر، القاي جهش ايندل را در دو كلون هتروزيگوت و يك كلون هموزيگوت تاييد كرد. بحث و نتيجه گيري: در اين مطالعه، ما با استفاده از سيستم CRISPRCas9 يك مدل سلولي سندرم هورلر توليد كرديم كه اين مدل مي تواند جهت استفاده در رويكرد هاي درماني اين بيماري استفاده شود.