كلون سازي و بيان ژن هيرودين نوتركيب در رده سلولي CHO

Cloning and expression of recombinant hirudin in CHO cell line

هيرودين پروتئيني به طول 66-65 اسيدآمينه مي باشد كه از غدد بزاقي زالو ترشح و به عنوان يك داروي ضدانعقاد مطرح است. اين دارو مهاركننده بسيار قوي ترومبين بوده و در ممانعت از ترومبوسهاي عروقي موثر است. هدف از اين تحقيق بررسي بيان ژن هيرودين در سلول هاي CHO به عنوان يك سلول يوكاريوتي بود. در مطالعه حاضر، قطعه 221 بازي ژن هيرودين در وكتور pcDNA3.1(+) كلون گرديد. وكتور نوتركيب هيرودين در سلول CHO با استفاده از ليپوفكتامين ترانسفكت گرديد. بيان ژن هيرودين به وسيله RT-PCR سنجش گرديد. در نهايت بيان ژن هيرودين با PCR و هضم آنزيمي تاييد گرديد. وكتور نوتركيب در اين تحقيق با موفقيت آزمون گرديد. يافته هاي تحقيق نشان داد كه بيان ژن هيرودين با موفقيت صورت گرفته است. پلاسميد نوتركيب، mRNA مربوط به هيرودين را در سلول CHO بيان كرد. بنابراين پروتئين نوتركيب توليدي در اين مطالعه مي تواند در تحقيقات بعدي به عنوان يكي از روش هاي مكمل در امر درمان و اختلالات قلبي عروقي و انعقادي مورد توجه قرار گيرد و به كار گرفته شود.

Hirudin is a 65-66 amino acids polypeptide which is secreted as an anticoagulant compound from salivary glands of medical leech. This drug is a very potent inhibitor of thrombin and is so effective for arterial and venous thrombosis prevention. The aim of the present research was to clone and express of hirudin gene in CHO cell line as a eukaryotic host cell. In this experimental study, a 221 bp fragment of hirudin gene was cloned into pcDNA3.1(+) vector. The pcDNA3.1(+)-hirudin recombinant vector was transfected into CHO cells by lipofectamine 2000 reagent. The eukaryotic expression of hirudin was evaluated by RT-PCR method. The pcDNA3.1(+)-hirudin recombinant vector was confirmed by PCR and enzymatic double digestion. Our findings showed that the mammalian expression of hirudin was successful. As, a 221 bp fragment corresponded to hirudin mRNA was observed on agarose gel after RT-PCR. The pcDNA3.1(+)-hirudin recombinant vector was constructed in this research successfully. This new recombinant plasmid can express the hirudin mRNA in CHO cells. Therefore, the recombinant protein that produced from this research can be a recombinant vaccine that could be applied for future research. Additionally, this construct has the potential to be use as DNA vaccine in next experiments.