القاء پلي‌پلوئيدي با استفاده از كلشي‌سين و شناسائي آن از طريق ويژگي‌هاي سيتولوژيكي در گل سوسن (Lilium dandie)

The induction of polyploidy by using of colchicine and its identification through cytological traits in Lilium dandie

سابقه و هدف: به نژادگران همواره به دنبال منابع ايجاد تنوع در گياهان مختلف هستند. از آنجا كه جهش‌هاي خود به خودي در گياهان به ندرت اتفاق مي‌افتد، توليد جهش يافته‌هاي القائي روش مناسب‌تري براي ايجاد تنوع در گياهان محسوب مي‌شود. لذا دستورزي سطح پلوئيدي از طريق موتاژنها به‌ويژه موتاژن‌هاي شيميايي در سلول‌هاي سوماتيكي امكان بهنژادي به منظور توليد واريته-هاي جديد و با صفات برتر و مطلوب در بسياري از گونه‌هاي گياهي را موفقيت آميزتر نموده است. گونه‌هاي گياهي با بيش از دو سري كروموزومي (پلي‌پلوئيد) به علت افزايش تنوع ژنتيكي در سلسله گياهان در سازگار كردن بهتر آنها در محيط‌هاي جديد، تكامل طبيعي و به نژادي گياهان از اهميت ويژه‌اي برخوردار هستند. بر همين اساس پژوهشي به منظور القاي پلي‌پلوئيدي از طريق كلشي‌سين بصورت درون‌شيشه‌اي در يكي از گونه‌هاي جديد هيبريد آسيايي گل سوسن (Lilium dandie) انجام گرفت كه داراي پتانسيل بالاي زينتي و دارويي مي‌باشد. مواد و روش‌ها: در اين آزمايش فلس‌هاي سوخك درون شيشه‌اي در قالب طرح كاملاً تصادفي به صورت فاكتوريل در غلظت-هاي مختلف محلول كلشي‌سين ( 0/01، 0/05 و 0/1 درصد) به مدت 6، 12 و 24 ساعت تيمار گرديد سپس نمونه‌هاي فلسي جهت باززايي و رشد عادي در محيط كشت بدون تنظيم كننده‌هاي رشدي واكشت شدند. پس از بررسي ميزان زنده‌ماني، سطح پلوئيدي گياهچه‌هاي باززايي شده از طريق شمارش مستقيم تعداد كروموزوم‌هاي مريستمي نوك ريشه‌ها تعيين گرديد. طول، عرض و تراكم روزنه برگ با استفاده از تكنيك لاك بي‌رنگ و شمارش مستقيم تعداد كلروپلاست سلولهاي محافظ روزنه‌ در برگ‌هاي بالغ و توسعه يافته به عنوان فاكتورهاي سيتولوژيكي و بين گياهچه‌هاي شاهد (ديپلوئيد) و پلي‌پلوئيد (تريپلوئيد) مورد مقايسه قرار گرفت وزن تر گياهچه‌ها با استفاده از ترازو و شاخص‌هاي مورفولوژيكي طول و عرض برگ و طول ريشه نيز از طريق خط‌كش دقيق اندازه‌گيري شد. يافته‌ها: بررسي نتايج نشان داد كه با افزايش غلظت و مدت زمان تيمار ريزنمونه‌هاي فلسي با كلشي‌سين ميزان زنده‌ماني آن‌ها كاهش يافت، كلشي‌سين در القاء پلي‌پلوئيدي (تريپلوئيدي) گل سوسن كاملاً كارآمد و موثر بوده و بيشترين ميزان پلي‌پلوئيدي (%24/55) در مدت زمان 12 ساعت اتفاق افتاد و بالاترين ضريب بهره‌وري نيز در اين مدت زمان از تيمار %0/01 كلشي‌سين به‌دست آمد. در گياهچه‌هاي پلي‌پلوئيد نسبت به شاهد (ديپلوئيد) تراكم روزنه بطور معني‌داري كاهش يافت در حالي طول روزنه و تعداد كلروپلاست‌هاي موجود در سلول محافظ روزنه‌ همبستگي مثبتي با افزايش سطح پلوئيدي نشان داد. شاخص‌هاي وزن تر و ويژگي‌هاي مورفولوژيكي طول و عرض برگ و همچنين طول ريشه در گياهچه‌هاي پلي‌پلوئيد در مقايسه با گياهچه‌هاي شاهد بطور معني‌داري افزايش نشان داد. نتيجه‌گيري: كاربرد كلشي‌سين در القاء پلي‌پلوئيدي در گل سوسن كاملاً موفقيت‌آميز بوده و بيشترين بهره‌وري پلي‌پلوئيدي (%42/85) در مدت زمان 12 ساعت تيمار بهينه شد. تراكم پايين و طول بيشتر روزنه و همچنين تعداد كلروپلاست بالاي سلولهاي محافظ روزنه در گياهچه‌هاي پلي‌پلوئيد نسبت به ديپلوئيد، شاخص خوبي براي غربال‌گري گياهچه‌هاي پلي‌پلوئيد مي‌باشد. شاخص‌هاي وزن تر و ويژگي‌هاي مورفولوژيكي طول و عرض برگ و طول ريشه گياهچه‌ها با افزايش سطح پلوئيدي افزايش مي‌يابد.

Background and objective: Breeders are always looking for sources of diversity in different plants. Because spontaneous mutations occur rarely in environment, induced mutation is a more appropriate method for plant diversity. Therefore, the ploidy level instruction through mutagens, especially chemical mutagens in somatic cells, has the potential to improve the ability to produce new varieties with superior and desirable traits in many plant species. Plant species with more than two chromosome (polyploid) sequences are of particular importance due to increased genetic variation in their better adaptation to new environments, natural evolution and plant breeding. Accordingly, an investigation was conducted to induce in vitro polyploidy through colchicine in a new species of asiatic hybrid Lilium dandie, which has high potential for ornamental and medicinal. Material and Methods: In this experiment, in vitro bulb scales were treated in a completely randomized design with factorial arrangement in different concentrations of filter sterilized colchicine solution (0.01, 0.05 and 0.1%) for 6, 12 and 24 hours. Then samples were taken to regenerate and grow normally in a culture medium without growth regulators. After assessing the survival rate, ploidy levels of regenerated plantlets by direct counting of the number of root meristem chromosomes were determined. Length, width and density of leaf apertures using bachelor varnish technique and direct counting of chloroplast number of stomatal guard cells in adult and developed leaves as cytological factors between the control (diploid) and polypoid (triploid) plantlets was compared. plantlet fresh weight was also measured using scales and morphological indices of leaf length and width and root length were measured by precise ruler. Results: The results of this study showed that with increasing concentration and duration of treatment of colchicine, the survival rate of explants decreased. colchicine was completely effective in inducing polyploidy (triploid) L. dandie and the highest amount of polyploidy (14) occurred during 12 hours. The highest efficiency of productivity was obtained during treatment with 0.01% colchicine. In the polyploid plantlets, the stomatal density decreased significantly compared to the control, while the stomatal length and the number of chloroplasts in the stomatal guard cells showed a positive correlation with the increase in ploidy levels. Fresh weight and morphological characteristics of leaf length and width as well as root length in polyploidy plantlets were significantly increased compared to control. Conclusion: The use of colchicine in polyploidy induction in L. dandie was completely successful and the highest polyploidy productivity (42.85%) was optimized for 12 hours treatment. Low density and longer stomatal length, as well as high chloroplast count in the chloroplast guard cells in polyploid plantlets, are a good indicator of polyploid plantlets screening than diploid plantlets. Fresh weight indices and morphological characteristics of leaf length and root width and plantlets length increased with increasing ploidy level.