جداسازي باكتري­ هاي نمك ­دوست مولد اوره­ آز و مطالعه توليد نانوكريستال آن­ ها

The isolation of halophilic urease-producing bacteria and the study of their nano-crystal production

باكتري­ هاي مولد آنزيم اوره ­آز مي­ توانند با توليد اوره ­آز در حضور اوره و كلسيم نانوكريستال­ هاي كلسيت توليد كنند. رسوب كلسيت طي فعاليت ميكروبي فرايندي است كه موجب سيماني شدن ذرات خاك در طبيعت مي­ شود. هدف از اين بررسي جداسازي باكتري­ هاي نمك­ دوست مولد اوره ­آز به منظور رسوب كلسيت در خاك ­هاي شور بود. نمونه ­هاي طبيعي اعم از خاك و آب­ هاي شور براي اين منظور انتخاب شدند. ابتدا با استفاده از محيط­ هاي TSB حاوي نمك باكتري­ هاي نمك دوست و سپس با استفاده از محيط­ هاي اختصاصي حاوي اوره و فنل رد باكتري­ هاي مولد اوره ­آز جداسازي شدند. جدايه‌هاي مولد اوره ­آز با آزادسازي آمونيوم موجب قليايي شدن محيط كشت و تشكيل هاله صورتي رنگ اطراف كلني ­ها مي ­شدند. سپس باكتري­ هاي منتخب كه هاله بيش تري داشتند طي سنجش آزادسازي آمونيوم به روش نسلر تحت بررسي قرار گرفتند. توانايي يا عدم توانايي توليد نانوكريستال جدايه­ ها با كشت به مدت 10 روز بر روي محيط رسوبي حاوي درصد نمك­ هاي متفاوت تحت بررسي قرار گرفت. مجموعا 110 جدايه نمك دوست جداسازي شد كه از اين ميان 58 جدايه مولد اوره ­آز بودند. مطالعات ميكروسكوپي كلني ­ها نشان داد كه تنها 6 جدايه بر روي محيط ­هاي رسوبي قادر به توليد كريستال هستند. جدايه­ 6 به منظور مطالعات بيشتر انتخاب و خصوصيات كريستال­ هاي آن طي تحليل­ هايي توسط XRD و ميكروسكوپ الكتروني روبشي (SEM) مجهز به EDX تحت بررسي قرار گرفت. مطالعات فعاليت اوره­ آزي نشان داد كه اين جدايه داراي قدرت آزادسازي آمونيوم به ميزان 20/86 ميلي ­مولار آمونيوم بعد از 18 ساعت است. اين باكتري طي تست­ هاي بيوشيميايي و مولكولي شناسايي شد و مقايسه توالي 16S rRNA آن تشابه 92/99 درصدي با استافيلوكوكوس زايلوسوس نشان داد و در بانك ژنومي NCBI با شماره دسترسي MG655155 ثبت شد. اين مطالعه نشان داد كه اين باكتري در محيط­ فاقد نمك و محيط حتي با نمك 10 درصد قادر به توليدكلسيت است. امروزه تلاش‌هاي زيادي در جهت توليد سيمان‌هاي پاك و زيستي انجام شده است و از همين رو استفاده از باكتري­ هاي متحمل به نمك مولد اوره­ آز كانديداهاي مناسبي به منظور سيمان سازي زيستي در محيط ­هاي شور است.

alcite precipitation resulting from microbial activity is a process which causes cementation of soil particles in nature. The purpose of this study was to isolate urease-producing halophilic bacteria in order to precipitate calcite in saline soil. Natural samples, including soil and saline waters, were selected for this purpose. At First, halophilic bacteria were isolated by salt-containing TSB medium. Then, a selective medium containing phenol red and urea facilitated the isolation of urease-producing bacteria. Hydrolysis of urea by urease causes alkalization of the medium and the formation of pink halo around colonies. Finally, the best isolate was selected for further study by measuring the release of ammonium by the Nessler method. The ability or inability of isolates to produce calcite was investigated by culturing the isolates on sedimentary medium with different salt concentrations for 10 days. In total, 110 halophilic isolates were isolated, among which 58 isolates had the ability of urease production. The microscopic studies of colonies showed that only 6 isolates were able to produce crystals on precipitation medium. Isolate 6 was selected for further study and then analyzed by X-ray diffraction crystals on precipitation medium. Isolate 6 was selected for further study and then analyzed by X-ray diffraction (XRD)and scanning electron microscope (SEM) equipped with an energy dispersive X-ray (EDX) detector. Studies of urease activity showed that this strain released 20.86 mM ammonium after 18 hours. This bacterium was identified by biochemical and molecular analyses and the comparison of its 16S rRNA gene sequence showed 99.92% similarity with the similar gene sequence in Staphylococcus xylosus and then this sequence was submitted in NCBI database with the accession number MG655155. This isolate was able to produce calcite in free salt medium, with salinity up to 10%. Nowadays, many efforts have been made to produce environmental-friendly cements, and therefore, the use of ureaseproducing halophilic bacteria is an appropriate candidate for bio-cementing in saline environments.