اثر افزودن عصاره اتانولي پونه و سيستئين به رقيق كننده بر ويژگي‌هاي باروري مني مجمد قوچ بلوچي پس از يخ‌گشايي

The effect of adding horsemint ethanol extract and cysteine into extender on fertility characteristic of frozen Baluchi ram semen after thawing

سابقه و هدف: با توجه به تمايل فزاينده پرورش دهنده‌گان گوسفند به استفاده از تلقيح مصنوعي، يافتن راهكارهايي براي حفط باردري مني منجمد قوچ مي‌تواند داراي اهميت و كاربردي باشد. يكي از اثرات منفي انجماد مني دام‌ها، افزايش راديكال‌هاي آزاد و در نتيجه افزايش پراكسيداسيون غشاي سلولي اسپرم است كه در نهايت باعث كاهش باروري مني پس از يخ‌گشايي مي‌گردد. برخي گياهان با داشتن سطوح بالاي آنتي‌اكسيدان طبيعي مي‌توانند به كاهش پراكسيداسيون مني كمك نمايند. از سوي ديگر، اسيد آمينه سيستئين به عنوان پيش‌ساز گلوتاتيون، يكي از ظرفيت‌هاي آنتي‌اكسيدانتي مني به شمار مي‌رود. بنابراين، هدف از اين پژوهش بررسي اثر افزودن عصاره اتانولي گياه پونه به عنوان منبع آنتي‌اكسيدانت‌هاي طبيعي و اسيد آمينه سيستئين به مني قوچ بر ويژگي‌هاي باروري مني پس از فرآيند انجماد و يخ‌گشايي بود. مواد و روش‌ها: در اين تحقيق نمونه‌هاي مني از چهار رأس قوچ بلوچي بالغ و بارور (ميانگين سن بيش از دو سال) با استفاده از مهبل مصنوعي جمع آوري گرديد و پس از ارزيابي اوليه با يكديگر مخلوط شدند. سپس نمونه‌ها با استفاده از رقيق كننده مني بر پايه تريس- زرده تخم مرغ رقيق‌سازي گرديدند. تيمارهاي آزمايش بصورت (3×3) در قالب فاكتوريل طرح كاملا تصادفي با 9 تيمار و 6 تكرار انجام شده كه به هر گروه تيماري شش ني (پايوت) اختصاص يافت. پس از افزودن سطوح مختلف عصاره اتانولي پونه (صفر، 100 و 200 ميكروليتر بر ميلي‌ليتر) و اسيد آمينه سيستئين (صفر، 5 و 10 ميلي‌مول)، ني‌هاي با مني پر شده و به مدت دو ساعت در دماي يخچال (چهار درجه سانتي‌گراد) خنك شدند و سپس در نيتروژون مايع، منجمد و به مخزن نيتروژن منتقل شدند. پس از گذشت 10 روز، يخ‌گشايي ني‌ها در آب ولرم انجام شد و فراسنجه‌هاي حركتي اسپرم توسط دستگاه ارزيابي كامپيوتري ارزيابي شد. درصد زنده‌ماني، يكپارچگي غشاي پلاسمايي و ريخت‌شناسي طبيعي اسپرم‌ها به كمك ميكروسكوپ ارزيابي شد. داده‌هاي اين پژوهش با استفاده از نرم‌افزار آماري SAS با رويه GLM مورد تجزيه و تحليل قرار گرفتند. تفاوت آماري بين ميانگين‌ها نيز با استفاده از آزمون توكي-كرامر (درسطح احتمال 5 درصد) انجام شد. يافته‌ها: نتايج نشان داد كه اثر افزودن عصاره گياه پونه و سيستئين و همچنين برهم‌كنش آن‌ها بر همه فراسنجه‌هاي جنبايي و زنده‌ماني اسپرم منجمد قوچ پس از يخ‌گشايي معني‌دار بود (05/0P<) بجز درصد اسپرم‌ها با ريخت‌شناسي غيرطبيعي كه صرفا اثر افزودن سيستئين معني‌دار بود. نتايج مقايسه ميانگين‌ها نشان داد كه بيشترين جنبايي كل، يكپارچگي غشاي پلاسمايي، خطي بودن جنبايي و سرعت در مسير منحني اسپرم در تيمار سيستئين 10 (بدون عصاره پونه) و بيشترين زنده‌ماني، سرعت اسپرم در مسير مستقيم و سرعت اسپرم در مسير ميانگين در تيمار سيستئين 5 مشاهده شد. بيشترين درصد جنبايي پيش‌رونده اسپرم در تيمار عصاره پونه 200 (بدون سيستئين) بود. نتيجه‌گيري: به طور كلي با توجه به تاثير مثبت افزودن اسيدآمينه سيستئين در رقيق كننده بر پايه تريس–زرده تخم مرغ بر بيشتر فراسنجه‌هاي باروري اسپرم منجمد پس از يخ‌گشايي، استفاده از سطوح 5 و 10 ميلي‌مول سيستئين در هر ميلي‌ليتر رقيق كننده براي حفظ باروري مني منجمد قوچ پيشنهاد مي‌گردد.

Background and goal: According to an increasing interest for using artificial insemination by sheep producers, finding methods to maintain frozen semen fertility would be important and applicable. One of the freezing semen disadvantages is increasing of free radicals led to enhanced sperm membrane peroxidation then consequently causes lowered semen fertility after thawing. Some plants bearing high levels of plant antioxidants can help to decrease semen peroxidation. Cysteine, in addition, is a precursor of glutathione peroxidase being the most important antioxidant property in semen. Therefore, the aim of the study was to investigate the effect of adding different levels of ethanol extract of Mentha Longifolia (0, 100 and 200 microL/ml) and cysteine (0, 5 and 10 mmol/l) into ram semen on fertility features after freezing and thawing processes. Materials and methods: In the study, semen samples were collected from four mature, fertile Baluchi rams (> 2y-old) by artificial vagina and after initial evaluation were pooled together. Then, samples were extended in an extender based on Tris-egg yolk. Treatments were arranged as a 3×3 factorial experiment including nine treatments and six straws were assigned to each as replicate. After treating, the straws were filled by the equal amount of semen and after chilling in refrigerator (4 °C) for two hours were frozen in liquid nitrogen container. After thawing the straws at day 10, sperm motility parameters were assayed by CASA. Furthermore, the percentages of viability, plasma membrane integrity and normal morphology of sperms were evaluated by microscope. Data were analyzed by SAS software using GLM procedure and the means comparison was performed by Tukey-Kramer test at 5% error. Results: Results of the study showed that the effects of adding horsemint extract and cysteine into the extender and the interaction between them on the all motility and viability parameters of frozen ram sperm after thawing were significant (p<0.05), exempt for sperm morphology where only the effect of adding cysteine was significant. Means comparison showed that the greatest sperm total motility, plasma membrane integrity, linearity and curvilinear velocity were observed in cysteine10 treatment (without horsemint extract), while the greatest sperm viability, straight line velocity and average path velocity were seen in cysteine5 treatment (without horsemint extract). The greatest sperm progressive motility percentage was observed in horsemint200 group (without cysteine). Conclusion: In general, considering to the beneficial effect of adding cysteine into the extender based on tris- egg yolk on the most of fertility parameters of ram frozen semen after thawing, using levels of 5 and 10 mmol cysteine per ml extender in order to maintain fertility of frozen ram semen is recommended.