تأثير شرايط محيطي و پارامترهاي اسپرم در ترانسفكشن اسپرم گوسفند با DNA خارجي

Effects of sperm parameters and incubation conditions of sperms with foreign DNA in ovine sperm transfection

انتقال ژن به واسطه­ي اسپرم (SMGT) براي اولين بار در سال 1989 معرفي شد و از همان زمان موضوعي چالش­انگيز بوده است. از جمله چالش­هاي جدي آن عدم تحرك اسپرم‌هاي حاوي DNA خارجي و در نتيجه قابليت لقاح اين اسپرم‌ها بوده است. هدف از اين مطالعه بررسي اثر شرايط محيطي گرمخانه­گذاري اسپرم با DNA خارجي و محيط ترانسفكشن و همچنين تأثير پارامترهاي اسپرم در ميزان ترانسفكشن اسپرم گوسفند است. در اين تحقيق اثر دماي مختلف انكوباسيون (5، 20 و ºC 37)، سه محيط مختلف (PBS، TCM و DMEM)، حضور FBS در محيط، زنده­ماني و تحرك اسپرم و ظرفيت­پذيري اسپرم در ميزان و شدت جذب DNA با استفاده از پلاسميد EGFP نشان­دار شده با رودامين ارزيابي شد. نتايج نشان دادند كه گرمخانه­گذاري اسپرم‌ها با پلاسميد در 37 درجه­ي سانتي­گراد ميزان جذب بيشتري به دنبال داشت اما محيط­هاي مختلف مورد بررسي و حضور يا عدم حضور FBS اثر معني‌داري در ميزان ترانسفكشن اسپرم نداشتند. همچنين ميزان تحرك اسپرم و ظرفيت­گيري اسپرم‌ها نيز اثر معني‌داري در ميزان جذب نداشتند. در همه­ي آزمايشات انجام شده تمام اسپرم‌هاي داري جذب واقعي DNA خارجي (جذب در ناحيه­ي پشت آكروزوم) غيرمتحرك بودند و تغيير فاكتورهاي مورد آزمايش نتوانست اسپرم ترانسفكت شده متحرك به دست بدهد. با توجه به نتايج مطالعه­ي حاضر به نظر مي­رسد كه مي­توان از اسپرم‌هاي با غشاي آسيب ديده همراه با تزريق داخل سيتوپلاسمي اين اسپرم‌ها جهت انتقال ژن به واسطه­ي اسپرم (SMGT-ICSI) براي توليد حيوانات ترانس ژنيك استفاده كرد. كليدواژه‌ها

Sperm-mediated gene transfer (SMGT) based on the intrinsic ability of sperms to bind and take-up of exogenous DNA was introduced in 1989. From that time on, it has been a challenging topic. One of the serious challenges was the motility of transfected sperms and hence their ability to fertilize the oocyte. The present study aimed to determine the effects of media and incubation conditions and also sperm parameters on the transfection of ovine spermatozoa by foreign DNA. In this study, the effects of various incubation temperature (5, 20 and 37 ºC), three different media (PBS, TCM and DMEM), presence of FBS in medium, viability and motility of sperms and sperm capacitation in DNA absorption rate and intensity were assessed by using rhodamine-labeled EGFP plasmid. Results showed that incubation of spermatozoa with plasmid in 37ºC leads to more transfection rate but various incubation media and presence or absence of FBS had no significant effect on DNA uptake rate and intensity. Motility rate and capacitation of sperms had no significant effects too. However, in sperms with a damaged membrane, the DNA uptake rate increased significantly. All of the spermatozoa with true DNA absorption (post acrosome absorption) were immotile and none of the examined treatments in this study could produce motile transfected spermatozoa. Regarding the results of this study, it seems that membrane-damaged spermatozoa incubated with foreign DNA can be used for SMGT-ICSI to produce transgenic animals.