بيوتكنولوژي انتقال ژن در ماهي زبرا به عنوان مدل تحقيقاتي انتقال ژن در آبزيان پرورشي

Gene transfer biotechnology in zebrafish as a gene transfer research model in farmed aquatic animals

جهت ايجاد ماهي رنگي زينتي زبرا، واكنش زنجيره­اي پليمراز (PCR) با استفاده از آغازگرهاي طراحي شده براي پيشبر دو ژن انتخاب شده در سلول­هاي عضلاتي و همسانه­سازي اين قطعات ژني در وكتور Tol2 كه خود حاوي ژن پروتئين فلوئورسنت سبز (GFP) بود در ناحيه خوانش باز (ORF) صورت گرفت. به ترتيب قطعات 2000 و 2300 جفت بازيِ ناحيه پيشبر ژن­هاي MYLZ2 و CKMB بوسيله واكنش زنجيره­اي پليمراز تكثير شده، در وكتور بياني Tol2 داراي جايگاه برشي آنزيم SalI همسانه­سازي شد و به باكتري اشريشياكلي (E. coli) سويه Dh5α انتقال يافت. همسانه­هاي مثبت توسط colony PCR با استفاده از آغازگرها مورد بررسي قرار گرفت و براي استخراج پلاسميد نوتركيب كشت شد. پلاسميد نوتركيب استخراج شده توسط هضم آنزيمي SalI بررسي شد و به كمك آغازگرهاي عمومي تعيين توالي گرديدند. در اين مطالعه، به ترتيب قطعات 2000 و 2300 جفت بازيِ راه انداز ژن­هاي MYLZ2 و CKMB در وكتور بياني Tol2 همسانه­سازي شدند كه تاييد آن با استفاده از واكنش زنجيره­اي پليمراز، توالي­يابي و هضم آنزيمي صورت گرفت. همچنين، پلاسميد نوتركيب كشت داده شد و براي تزريق به همراه يك رونوشت سنتتيك خالص­سازي گرديد. جنين­هاي تك سلولي تزريق شده (توسط پلاسميد نوتركيب و رونوشت) به وسيله ميكروسكوپ فلوئورسنس براي بررسي بيان GFP آزمايش شدند و مشخص شد كه بيان GFP در سلول­هاي عضلاني برخي از نتاج نسل F0 روي داده است. پلاسميدهاي نوتركيب شده با استفاده از پيشبرهاي مختص سلول­هاي عضلاني (MYLZ2 و CKMB) قادر به القاء بيان GFP در برخي از جنين­هاي نسل F0 به صورت موقت بودند و از اين رو مي توانند جهت تثبيت بيان در نسل­هاي بعدي ماهي استفاده شوند.

The polymerase chain reaction (PCR) was applied to create the colored transgenic ornamental zebrafish with the specific primers designed for muscle promoter of two genes and genes fragments cloned in Tol2 vector containing GFP gene in the ORF region. The 2000 bp and 2300 bp fragments of MYLZ2 and CKMB promoters' genes respectively were amplified by PCR, cloned into Tol2 plasmid expression vector containing SalI restriction enzyme site and transformed into E. coli Dh5α. Positive clones were tested for having fragments by colony PCR with anchor primers and subcultured for extracting recombinant plasmid miniprep. The extracted recombinant plasmid was tested with SalI enzyme digestion and sequenced with universal primers. Positive recombinant plasmids were applied for injection with transcript produced synthetically in the lab into zebrafish one-cell embryo. In this study, 2000 bp and 2300 bp fragments of MYLZ2 and CKMB promoters, respectively, were cloned in an expression vector Tol2 and confirmed by PCR, sequencing and enzymatic digestion. Also, recombinant plasmid was subcultured and purified for injection with a synthetic transcript. One-cell embryos injected by coinjection materials (recombinant plasmid and transcript) were tested by fluorescence microscope for positive GFP expression, where a few offspring of F0 generation were positive for GFP expression in their muscles. Recombinant plasmids with muscle-specific promoters (MYLZ2 and CKMB) were able to induce expression of GFP in some F0 embryos in a transient form and could be applied for consolidation in the next fish generation.