تكثير و همسانه سازي ژن سه قسمتي lsc در وكتور pcDNA3.1 و بررسي بيان آن در لاين سلولي

PCR and cloning of the lcs chimeric gene in pcDNA3.1 vector and its expression in the cell line

سابقه‌ و هدف: اسهال دومين عامل رايج مرگ و مير كودكان زير 5 سال است. مهم­ترين سويه ­هاي بيماري­زايي اشريشياكلي انتروتوكسيژنيك با توليد سم Lt و St موجب بيماري اسهال مسافران و اشريشياكلي انتروهموراژيك با ترشح سم شبه شيگا موجب اسهال خوني مي­ شود. زيرواحد B انتروتوكسين كلره در باكتري ويبريوكلرا در ايجاد بيماري اسهال نقش به­ سزايي دارد.به­احتمال با تركيب اپي-توپ­هاي CtxB، LtB و StB (LSC) و توليد واكسن تري والان مي ­توان آنتي­بادي اختصاصي تري براي مقابله با اين سموم ايجاد كرد. هدف از اين تحقيق تكثير ژن كايمر lsc جهت كلونينگ در وكتور pcDNA3.1(+) به­ منظور طراحي DNA واكسن و بررسي بيان در وكتور يوكاريوتيك است. مواد و روش­ ها: توالي ژن lsc پس از طراحي پرايمر و تكثير به ­وسيله PCR به وكتورpcDNA3.1(+) منتقل شد. وكتور pcDNA3.1(+) و محصول PCR با استفاده از آنزيم HindIII و EcoRI مورد هضم قرار گرفت. كلونينگ ژن lsc در وكتورpcDNA3.1(+) و PCR انجام شد. كلون­ها مورد هضم آنزيمي قرار گرفتند. جهت اطمينان از بيان ژن lsc به سلول HEK-293T منتقل و با استفاده از روش وسترن بلاتينگ مورد تأييد قرار گرفت. يافته­ ها: ژن lsc پس از PCR و كلونينگ در وكتورpcDNA3.1(+) با استفاده از هضم آنزيمي مورد تأييد قرار گرفت و قطعه ­اي به­ طول bp933 رويت و تأييد شد. سپس با استفاده از كيت توربوفكت به سلول HEK-293T منتقل و بيان پروتئين نوتركيب به روش وسترن بلاتينگ مورد تأييد قرار گرفت و پروتئين به وزن 39 كيلودالتون تأييد شد. نتيجه‌گيري: نتايج به دست آمده از ژن كايمر به­خوبي در لاين سلولي بيان و توسط وسترن بلاتينگ تأييد شد كه مي­تواند كانديد مناسبي براي مقابله با عفونت باكتريايي باشد.

Aim and Background: Diarrhea is the second most common cause of under-5 mortality. The most important strains of Entrotoxigenic Escherichia coli causing Lt and St toxin cause diarrhea and Entrohemoragic E.coli causing Shiga-like toxin secretion. Chlorine enterotoxin B subunit (Ctx) plays a key role in the development of diarrhea in Vibrio cholerae. More specific antibodies could be developed to counter these toxins by combining the CtxB, LtB and StB (LSC) epitopes and the production of trivalent vaccine. The aim of this study was to cloning lsc gene into pcDNA3.1 to design a vaccine DNA. Materials and Methods: The lsc gene sequence was transferred to pcDNA3.1(+) vector after primer design and amplification by PCR. The pcDNA3.1(+) vector and the PCR product were digested using HindIII and EcoRI enzymes. Cloning of lsc gene was performed in pcDNA3.1(+) vector and PCR. The clones were digested enzymatically. To ensure expression of lsc gene, it was transferred to HEK-293T cell and confirmed by Western blotting. Results: The lsc gene was confirmed by PCR and cloning in pcDNA3.1(+) vector using enzymatic digestion and a fragment length of 933 bp was detected and confirmed. Transfection kit was then transferred to HEK-293T cell and expression of the recombinant protein was confirmed by Western blotting and the protein was 39 kDa. Conclusion: The results of the chimeric gene are well expressed in the cell line and confirmed by Western blotting that can be a good candidate for the fight against bacterial infection.