بيان هترولوگ، خالص سازي و سنجش فعاليت آنزيم كربوكسي پپتيداز نوتركيب جديد از باكتري كوهنلا A01

Heterologous Expression, Purification and Determination of Activity of new Carboxypepetidase from Cohnella Ao1

سابقه و هدف: آنزيم‌هاي تجزيه كننده پروتئين يا پروتئولايتيك با انجام هيدروليز برگشت­ ناپذير پيوند پپتيدي براي ادامه بقاي موجودات زنده ضروري هستند. كربوكسي‌پپتيدازها از جمله آنزيم‌هاي پروتئولايتيكي هستند كه در موجودات بسياري يافت مي‌شوند و از اين آنزيم‌ها در صنايع مختلف - مثل صنايع غذايي و داروسازي – به­ وفور استفاده مي‌شود. هدف از اين تحقيق، بيان آنزيم كربوكسي پپتيداز باكتري بومي كوهنلا A01، خالص ­سازي و سنجش فعاليت آن است. مواد و روش­ ها: ابتدا ژن كربوكسي پپتيداز كوهنلا A01 كه در وكتور pET-26b(+) كلون شده بود؛ با ايجاد سلول­ هاي مستعد از باكتري ميزبان بياني (اشرشياكلي BL21) وارد آن گرديد. اين باكتري در محيط كشت LB تلقيح و با استفاده از IPTG ، بيان پروتئين القا شد. سپس سلول‌ها جمع ­آوري، شكسته شده، پروتئين بيان شده با استفاده از ستون كروماتوگرافي تمايلي نيكل سفاروز، تخليص شد. يافته­ ها: نتايج به ­دست آمده مشخص نمودند كه آنزيم نوتركيب بيان شده - طبق پيش ­بيني انجام شده - داراي ساختمان دومي با 34 درصد مارپيچ آلفا، 26 درصد صفحات بتا، 5 درصد نواحي فاقد ساختار و 35 درصد شامل لوپ و ساير ساختارها بوده، يك گلوتامات كربوكسي پپتيداز به­ شمار مي‌رود. اين آنزيم قادر است در دماي 50 درجه سلسيوس و pH معادل 7، ريشه گلوتامات را از اسيد فوليك جدا نمايد. وزن مولكولي آن kDa 6/41 بوده، فعاليت محاسبه شده اين آنزيم (با سوبستراي فولات) در شرايط سنجش، U/ml 179 است. نتيجه­ گيري: باتوجه­ به اين­كه گلوتامات كربوكسي پپتيداز (كربوكسي پپتيداز G) داراي كاربرد دارويي است و كربوكسي پپتيداز نوتركيب كوهنلا A01 داراي مقاومت گرمايي و در نتيجه پايداري مناسب در دماي محيط است، به ­احتمال مي‌توان از اين آنزيم پس از بهينه­ سازي، در مصارف دارويي استفاده نمود.

Aim and Background: Proteolytic enzymes are essential for the survival of living organisms by irreversible hydrolysis of peptide bond. Carboxypeptidases are proteolytic enzymes found in many organisms and are widely used in various industries, such as food and pharmaceuticals. Aims of this study are expression of carboxypeptidase of chohnella A01, purification and determination of its activity. Materials and methods: The gene of carboxypeptidase of cohnella A01 has been cloned in pET26b(+) vector. Competent cells were prepared from E. coli BL21, plasmids were extracted and transformed to expression host. E. coli BL21 was cultured in LB medium and protein expression was induced by IPTG. After that cell harvested and recombinant protein was purified by Ni-TNA resin. Results: The expressed recombinant enzyme is a glutamate carboxypeptidase that capable of separating glutamate from folic acid. Conclusion: Hence carboxypeptidase G has medicinal application and recombinant carboxypeptidase from cohnella A01 is a thermostable enzyme, after optimization, can be use it for medicinal application.