توليد دمين نوتركيب متالوپروتئيناز ايكارين به عنوان فعال كننده اصلي پروترومبين در سلول HEK293

Recombinant Production of metalloproteinase domain of Ecarin as the main activator of prothrombin

سابقه و هدف: امروزه بيماران زيادي به دليل نقص يا عدم عملكرد فاكتورهاي انعقادي و استفاده از انواع داروهاي رقيق‌كننده خون درگير اختلالات انعقادي بوده و نيازمند بررسي كل پروترومبين و تعيين مقدار بازدارنده‌هاي مستقيم ترومبين مي‌باشند. با وجود مطالعه روي ايكارين سم مار جعفري، به عنوان يك فعال‌كننده مستقيم پروترومبين، هنوز در مورد مكان فعال اين آنزيم تحقيق و بررسي انجام نشده است. مواد و روش‌ها: دمين متالوپروتئيناز ايكارين با طول 639 جفت باز در وكتور pcDNA3.1 سنتز گرديد و پلاسميد يوكاريوتي نوتركيب به رده سلولي HEK293 انتقال يافت. با استفاده از روش‌ SDS-PAGE بيان پروتئين مورد ارزيابي قرار گرفت و عملكرد آن در واكنش با پروترومبين و با استفاده ازتست زمان پروترومبين سنجيده شد. يافته‌ها: نتايج نشان داد كه دمين متالوپروتئيناز ايكارين توليد شده در سيستم بياني HEK293 ، مانند ايكارين كامل، قادر به توليد ترومبين از پروترومبين است. اما در مقايسه با پروتئين مشابه توليد شده در سيستم پروكاريوتي، شروع فعاليت آن آهسته بود. نتيجه‌گيري: دراين بررسي دمين متالوپروتئينازي ايكارين كه به صورت نوتركيب در سلول‌‌‌هاي HEK293 توليد گرديد، همانند ايكارين كامل قادر به فعال كردن پروترومبين به ترومبين بود و براي اولين‌بار به عنوان يك جايگزين مناسب براي هر دو نوع ايكارين طبيعي و نوتركيب در روش‌هاي مبتني بر تبديل پروترومبين به ترومبين معرفي شد.

Aim and Background: Today, many patients with coagulation disorders due to defective or non-functioning coagulation factors and the use of various blood thinners need to check their prothrombin total and quantify determination of direct thrombin inhibitors. Despite the study of the ecarin from Echis carinatus venom as a direct activator of prothrombin, there have been not investigations into the active site of this enzyme. Material and methods: Ecarin metalloproteinase domain (639 bp) was synthesized into the pcDNA3.1. Recombinant plasmid was transfected into HEK293 cell line. Protein expression was evaluated using SDS-PAGE and its function in reaction with prothrombin and using a prothrombin time test was measured. Results: The results showed that the metalloproteinase domain of ecarin produced in the HEK293, like whole ecarin, was able to activate prothrombin to thrombin; but its activity was slow than one produced in the prokaryotic system. Conclusion: In this study, the recombinant ecarin metalloproteinase produced in HEK293 cells, like whole ecarin, was able to activate prothrombin to thrombin and was introduced for the first time as a suitable alternative to both natural and recombinant ecarin in methods based on prothrombin to thrombin conversion.