پديد آورندگان :
گروسي، شاهرخ دانشگاه محقق اردبيلي - دانشكده كشاورزي و منابع طبيعي - گروه مهندسي توليد و ژنتيك به نژادي، اردبيل، ايران , جهانبخش گده كهريز، سدابه دانشگاه محقق اردبيلي - دانشكده كشاورزي و منابع طبيعي - گروه مهندسي توليد و ژنتيك به نژادي، اردبيل، ايران , اصفهاني، كسري پژوهشگاه ملي مهندسي ژنتيك و زيست فناوري - پژوهشكده زيست فناوري كشاورزي - گروه زيست فرآورده هاي گياهي، تهران، ايران , لهراسبي، تهمينه پژوهشگاه ملي مهندسي ژنتيك و زيست فناوري - پژوهشكده زيست فناوري كشاورزي - گروه زيست فرآورده هاي گياهي، تهران، ايران , موسوي، امير پژوهشگاه ملي مهندسي ژنتيك و زيست فناوري - پژوهشكده زيست فناوري كشاورزي - گروه زيست فرآورده هاي مولكولي، تهران، ايران , هاتف سلمانيان، علي پژوهشگاه ملي مهندسي ژنتيك و زيست فناوري - پژوهشكده زيست فناوري كشاورزي - گروه زيست فرآورده هاي گياهي، تهران، ايران
چكيده فارسي :
هدف: گياهان كارآيي بسياري در توليد پروتئين‌هاي ارزشمند دارويي دارند. عامل رشد اپيدرمي انساني، اثرات بي‌شماري بر روي سيستم‌هاي مختلف سلولي داشته و نقش مهمي در بهبودي زخم‌ها و اندام‌زايي دارد. هدف از پژوهش اخير ساخت سازه‌هاي ويژه تك‌لپه‌اي‌ها براي انتقال بعدي ژن عامل رشد اپيدرمي و توليد انبوه آن در يك گياه تك‌لپه‌اي خودگشن يعني جو بود. گياه جو با داشتن عملكرد پروتئيني بالا و دگرگشني بسيار پايين، ميزبان ايده‌الي براي توليد عامل رشد اپيدرمي است.
مواد و روش‌ها: به‌منظور دسترسي به بالاترين ميزان بيان عامل رشد اپيدرمي در بذر جو، توالي ژن موردنظر بر اساس ترجيح كدوني گياه جو با نرم‌افزار COOL بهينه و همراه با پيش‌بر اختصاصي دي‌هوردئين سنتز شد. همچنين توالي راهنماي پپتيدي اندامك ذخيره‌اي پروتئين در بذر جو در ابتداي ناحيه رمزكننده قرار گرفت. پس از دريافت قطعه سنتزي در ناقل pUC57Hvorhegf، آن قطعه توسط آنزيم‌هاي SacI و HindIII از ناقل جدا و در پلاسميد pBI121 همسانه‌سازي شد. در گام بعدي همسانه‌سازي، براي درج توالي ژن موردنظر در ناقل pGH215، به دليل نبود جايگاه‌هاي شناسايي يكسان در اين ناقل‌ها، از ناقل حدواسط pBI121Gus-12 استفاده شد. بعد از برش ناقل همسانه‌سازي و pBI121Gus-12 توسط آنزيم‌هاي SacI و KpnI، همسانه‌سازي قطعه موردنظر در pBI121Gus-12 انجام گرفت. در گام آخر، ناقل pBI121G-12Hvorhegf و pGH215 با آنزيم‌هاي KpnI و SalI هضم شده و توالي موردنظر در مرز راست T-DNA و قبل از پايان دهنده NOS قرار گرفت.
نتايج: با استفاده از آزمون كلوني پي‌سي‌آر، الگوي هضم آنزيمي و توالي‌يابي با آغازگرهاي رفت‌وبرگشت، درستي همسانه‌سازي و توليد ناقل‌هاي pBI121Hvorhegf واجد ژن hegf با نشانگر كانامايسين و pGH215Hvorhegf واجد ژن hegf با نشانگر هيگرومايسين، مناسب براي انتقال ژن در تك‌لپه‌اي‌ها تائيد شد.
نتيجه‌گيري: ناقل بياني نوتركيب pGH215 تغييريافته داراي كاست ژني موردنظر همراه با نشانگر هيگرومايسين مي‌تواند براي انتقال ژن موردنظر در تك‌لپه‌اي‌ها و بيان پروتئين نوتركيب در اندام ذخيره‌اي بذر استفاده شود.
چكيده لاتين :
Objective
Plants are very efficient in producing valuable pharmaceutical proteins. Human epidermal growth factor (hEGF) has numerous effects on various cellular systems, including wound healing, organogenesis, and so on. The present study was carried out with the aim of constructing monocotyledonous-specific vectors for hegf insertion and mass-production in a self-pollinated crop, barley, afterwards. This crop plant, with high protein yield and very low cross-pollination, is an ideal host for the production of epidermal growth factor.
Materials and methods
The hegf sequence was optimized by COOL software, based on the codon preference of the host plant, and synthesized with a specific promoter, D-hordein. The encoding sequence of signal peptide targeting protein storage organelles in barley seeds was included at the beginning of the encoding area. The synthesized gene cassette was isolated from the cloning vector pUC57Hvorhegf by SacI and HindIII and cloned in pBI121. To insert the gene cassette of interest into pGH215, due to the lack of similar restriction sites in pUC57Hvorhegf and pGH215, the intermediate vector, pBI121Gus-12, was applied. After digesting pUC57Hvorhegf and pBI121Gus-12 by SacI and KpnI, the sequence of interest was incorporated into pBI121Gus-12. Finally, the recombinant pBI121Gus-12 and pGH215 were digested with KpnI and SalI, and the gene cassette was cloned at the right border of T-DNA, behind the NOS terminator.
Results
Cloning accuracy and constructing pBI121Hvorhegf and pGH215Hvorhegf vectors bearing kanamycin and hygromycin, respectively, suitable for monocotyledons-crop transformation was confirmed by colony PCR, digestion pattern, and sequencing with forward and reverse primers.
Conclusions
The modified recombinant expression vector pGH215 with the gene of interest carrying the hygromycin gene cassette, giving a high level of ability to select transformed explants, can be used to transfer desired genes in monocotyledons and express those genes in protein storage organelles.
