بهينه سازي تخليص پروتئين نوتركيب خارج غشايي (OMP) باكتري عامل بيماري گرينينگ مركبات

Optimizing purification processes of recombinant outer membrane protein (OMP) of Candidatus Liberibacter asiaticus causing agent of citrus greening

هدف: پروتئين خارج غشايي omp در سطح خارجي پيكره باكتري عامل بيماري گرينينگ مركبات (Candidatus Liberibacter asiaticus) وجود دارد. پروتئين مذكور مي تواند به عنوان آنتي‌ژن براي توليد انواع آنتي بادي هاي مونوكلونال و پلي كلونال مورد استفاده قرار گيرد. با اين‌حال خالص‌سازي پروتئين‌هاي غشايي به دليل وجود ساختارهاي آب‌گريز با مشكلات فراواني همراه مي‌باشد. در اين راستا، هدف از اجراي پژوهش حاضر، بهينه سازي استحصال و تخليص پروتئين نوتركيب omp مي باشد. مواد و روش‌ها: از سازه بياني باكتريايي pET28a حاوي ژن omp براي توليد نوتركيب اين پروتئين استفاده شد. بيان ژن omp در سويه Rosetta باكتري E. coli صورت پذيرفت. با توجه به آبگريز بودن پروتئين omp، خالص سازي آن در شرايط واسرشته مورد بررسي قرار گرفت. براي اين منظور از غلظت‌هاي مختلف سديم كلرايد، اوره و گوانيدين هيدروكلرايد در شرايط اسيدي pH متفاوت استفاده گرديد. به منظور دستيابي به پروتئين كاملا خالص نوتركيب، استحصال پروتئين از ژل پلي‌آكريل‌آميد با روش‌هاي مبتني بر سونيكاسيون، شستشوي توسط انتشار و الكتروالوشن صورت پذيرفت. بررسي كميت و كيفيت پروتئين هاي خالص شده با انجام الكتروفورز SDS-PAGE و محاسبه غلظت پروتئين با نرم افزار ImageJ انجام گرفت. همچنين براي تاييد ماهيت پروتئين خالص شده، آزمون وسترن بلات با استفاده از آنتي بادي هاي اختصاصي صورت پذيرفت. نتايج: نتايج اوليه نشان داد كه استفاده از غلظت 500 ميلي‌مولار سديم كلرايد به عنوان يك جزء ضروري در بافرهاي استخراج مي‌باشد. همچنين استفاده از اوره به عنوان عامل دناتوره‌كننده كارايي دو برابري نسبت به گوانيدين هيدروكلرايد در ميزان پروتئين تخليص شده داشت و بدين ترتيب بيشترين ميزان پروتئين (450 ميكروگرم در ميلي‌ليتر) زماني بدست آمد كه غلظت 8 مولار اوره در اجزاي بافري تخليص گنجانده شد. علاوه بر اين، نتايج مربوط به جداسازي باند پروتئين از ژل نشان داد كه روش الكتروالوشن بهترين كارايي را در بازيابي و جداسازي پروتئين هدف از ماتريكس ژل در مقايسه با روش سونيكاسيون و شستشوي توسط انتشار داشت. نتايج آزمون الكتروفورز پروتئين حاكي از وجود يك پروتئين با اندازه 34 كيلو دالتون متناسب با وزن مولكولي پروتئين omp مي باشد. آزمون وسترن بلات نيز مويد ماهيت پروتئين نوتركيب در ممبران بود. نتيجه‌گيري: مطالعه حاضر نشان داد كه استفاده از اوره با غلظت 8 مولار، نمك سديم كلرايد با غلظت 500 ميلي‌مولار به همراه تنظيم بافر الوشن روي (4) pH در مرحله تخليص پروتئين مي‌تواند به عنوان يك شرايط بهينه براي بدست آوردن بيشترين مقدار پروتئين هدف بكار رود. همچنين، روش الكتروالوشن به عنوان روش كارآمد جهت استحصال باند پروتئيني از روي ژل آكريل‌آميد معرفي شد.

Objective The omp (Outer membrane protein) protein located at outer surface of the bacterial membrane body agent citrus greening disease (Candidatus Liberibacter asiaticus). The mentioned-protein can be used as antigen for generating polyclonal and monoclonal antibodies. Therefore, the purification of membrane proteins is exposed to many problems due to presence of hydrophilic structure. The purpose of this study was optimizing recovery and purification of the recombinant omp protein. Materials and Methods The pET28a bacterial expression construct containing omp gene was used to recombinant production of the mentioned-protein. The omp gene expression was conducted in E. coli strain Rosetta-Gami2. With considering to be hydrophilic of omp protein, its purification was investigated under denature condition. To attain it, the different concentrations of NaCL, urea and guanidine at the different acidity pH condition was applied. To obtain the pure omp recombinant protein, the protein recovery from polyacrylamide gel was performed by methods based on elution by diffusion, sonication, and electroelution. The evaluation of quality and quantity purified protein was analyzed by SDS-PAGE and the protein concentration was calculated by ImageJ software. Also, to validate the purified proteins, Western blot was applied by specific antibody. Results Primary results showed that using the 500 mM NaCL was detected as an essential share in purification buffers. Also, using urea as denature agent had twice the efficiency on the quantity of purified protein more than guanidine hydrocholoride and thus, when 8 m urea supplemented in purification buffer, the highest purified protein was attained (450 µl/ml). Furthermore, the results related to recovery the single band of protein from gel indicated that the electroelution has highest efficient on recovery of the target protein from gel matrix compared to sonication and elution by diffusion methods. The results of SDS-PAGE confirmed to appear a protein with 34 kDa related to molecular weight of target protein. Western blot validated the recombinant protein in membrane. Conclusions The current study showed that using urea in 8 M, NaCL in 500 mM concentration in purification buffers following adjusting the elution buffer on pH (4) in elution purification step can be apply as an optimized condition to attain the highest target protein concentration. Furthermore, electroelution method introduced as efficient method in order to recovery band of the target protein from polyacrylamide gel matrix.