بررسي فعاليت آنتي‌اكسيداني و مهار آنزيم مبدل آنژيوتانسين پروتئين‌هاي هيدروليز شده جلبك اسپيرولينا پلاتنسيس Spirulina platensis با آنزيم‌هاي گوارشي

No title

اين تحقيق به‌منظور بررسي اثر هيدروليز آنزيمي پروتئين‌هاي ريز جلبك اسپيرولينا بر فعاليت آنتي‌اكسيداني و مهار آنزيم مبدل آنژيوتانسين انجام شد. اين پژوهش در سال‌هاي 1397 و 1398 در سازمان پژوهش‌هاي علمي و صنعتي ايران انجام شد. ريز جلبك اسپيرولينا در محيط كشت استاندارد زاروك كشت داده شد. بعد از شكستن ديواره سلولي با روش تركيبي انجماد-ذوب، براي غيرفعال كردن آنزيم‌هاي اسپيرولينا، نمونه حاصل در 85 درجه سانتي­گراد به مدت 15 دقيقه حرارت داده شد. بعد از سانتريفيوژ (g 9000، 15 دقيقه، 4 درجه سانتي­گراد)، مايع رويي حاصل در 20- درجه سانتي­گراد نگهداري شد. هيدروليز آنزيمي پروتئين‌هاي اسپيرولينا با تركيب‌هاي دوگانه و سه‌گانه آنزيم‌هاي پپسين، تريپسين و آلفا- كيموتريپسين در دماي 37 درجه سانتي­گراد و pH بهينه انجام گرفت. فعاليت آنزيم‌ها با جوشاندن در دماي 85 درجه سانتي­گراد به مدت 15 دقيقه متوقف شد. پروتئين‌هاي هيدروليز شده سانتريفيوژ و مايع رويي حاصل فراكشنه (جزءبه‌جزء) شد. ميزان پروتئين نمونه‌ها با تست لوري، ميزان پيشرفت درجه هيدروليز با استفاده از اورتو-فتال‌دي‌آلدئيد (OPA)، فعاليت آنتي‌اكسيداني با پاك‌سازي راديكال‌هاي 2 و 2-دي فنيل-1- پيكريل‌هيدرازيل (DPPH) و 2 و’2-آزينوبيس (3 اتيل-بنزوتيازولين-6-سولفونات) (ABTS) و فعاليت مهار آنزيم مبدل آنژيوتانسين (ACE) با سوبستراي فوريل‌آكريلوئيل- ال- فنيل‌آلانيل-گلايسيل- گلايسين FAPGG (Furilacriloil - L - phenylalanyl - glycyl - glycine) موردسنجش قرار گرفت. آزمايشات سه بار تكرار و معني‌داري با روش آماري آناليز واريانس يك‌طرفه موردبررسي قرار گرفت. درجه هيدروليز پروتئين‌هاي آبكافت شده اسپيرولينا با تركيب سه‌گانه آنزيم‌هاي پپسين+تريپسين+كيموتريپسين 260/1± 725/15 ميكرومولار لوسين بر ميلي‌گرم پروتئين و تركيب‌هاي دوگانه آنزيم‌هاي پپسين+ ﯿﻤﻮﺗﺮﯾﭙﺴﯿﻦ 1/260± 15/725 ﻣﯿﮑﺮوﻣﻮﻻر ﻟﻮﺳﯿﻦ ﺑﺮ ﻣﯿﻠﯽﮔﺮم ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ و ﺗﺮﮐﯿﺐﻫﺎي دوﮔﺎﻧﻪ آﻧﺰﯾﻢﻫﺎي ﭘﭙﺴﯿﻦ+ ﺗﺮﯾﭙﺴﯿﻦ 0/290 ± 15/294، ﭘﭙﺴﯿﻦ+ﮐﯿﻤﻮﺗﺮﯾﭙﺴﯿﻦ 0/653 ± 15/191 و ﺗﺮﯾﭙﺴﯿﻦ+ﮐﯿﻤﻮﺗﺮﯾﭙﺴﯿﻦ 1/031 ± 11/212 ﻣﯿﮑﺮوﻣﻮﻻر ﻟﻮﺳﯿﻦ ﺑﺮ ﻣﯿﻠﯽﮔﺮم ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ ﺑﻪ دﺳﺖ آﻣﺪ. ﻓﺮاﮐﺸﻦ ﭘﭙﺘﯿﺪي ﮐﻤﺘﺮ از 3 ﮐﯿﻠﻮ داﻟﺘﻮن ﻣﺤﺼﻮل ﻫﯿﺪروﻟﯿﺰ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ ﺑﺎ ﭘﭙﺴﯿﻦ+ﺗﺮﯾﭙﺴﯿﻦ ﺑﯿﺸﺘﺮﯾﻦ ﻓﻌﺎﻟﯿﺖ ﻣﻬﺎر رادﯾﮑﺎلﻫﺎي ABTS و DPPH را ﺑﻪ ﺗﺮﺗﯿﺐ ﺑﻪ ﻣﯿﺰان 11/53 ± 498/21 و 0/00 ± 48/650 ﻣﯿﮑﺮوﻣﻮﻻرﺗﺮوﻟﻮﮐﺲ ﺑﺮ ﻣﯿﻠﯽﮔﺮم ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ ﻧﺸﺎن داد ﮐﻪ ﺑﺎ ﺳﺎﯾﺮ ﻓﺮاﮐﺸﻦﻫﺎ اﺧﺘﻼف ﻣﻌﻨﯽدار داﺷﺖ )0/05˂P(. ﻏﻠﻈﺖ ﻣﻬﺎر ﻣﯿﺎﻧﻪ IC50( ﻓﻌﺎﻟﯿﺖ ﻣﻬﺎر آﻧﺰﯾﻢ ﻣﺒﺪل آﻧﮋﯾﻮﺗﺎﻧﺴﯿﻦ)ACE( ﻫﯿﺪروﻟﯿﺰات ﺣﺎﺻﻞ از اﺛﺮ آﻧﺰﯾﻢﻫﺎي ﺗﺮﯾﭙﺴﯿﻦ اﺳﺘﻔﺎده +ﮐﯿﻤﻮﺗﺮﯾﭙﺴﯿﻦ، ﭘﭙﺴﯿﻦ+ﺗﺮﯾﭙﺴﯿﻦ و ﭘﭙﺴﯿﻦ+ ﮐﯿﻤﻮﺗﺮﯾﭙﺴﯿﻦ اﺧﺘﻼف ﻣﻌﻨﯽدار ﻧﺪاﺷﺘﻨﺪ )0/05>P(. ﺑﺎ ﺗﻮﺟﻪ ﺑﻪ اﺛﺮات آﻧﺘﯽاﮐﺴﯿﺪاﻧﯽ ﻣﺸﺎﻫﺪهﺷﺪه، ﭘﭙﺘﯿﺪﻫﺎي ﻣﺸﺘﻖ از ﻫﯿﺪروﻟﯿﺰ آﻧﺰﯾﻤﯽ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦﻫﺎي اﺳﭙﯿﺮوﻟﯿﻨﺎ را ﻣﯽﺗﻮان ﺑﻪﻋﻨﻮان اﻓﺰودﻧﯽﻫﺎي ﻓﺮاﺳﻮدﻣﻨﺪ در ﻏﺬاﻫﺎ ﮐﺮد.

This study was performed to investigate the effect of enzymatic hydrolysis of Spirulina platensis protein on antioxidant and angiotensin converting enzyme inhibitory activities (ACE). This research was conducted in 2018-2019 in the Iranian Research Organization for Science and Technology. Spirulina platensis was grown in Zarrouk culture medium. The cell wall was disrupted by freeze-thawing and ultrasonication techniques. Spirulina platensis enzymes were inactivated with boiling at 850C for 15 min. After centrifugation (9000 g, 15 min, 40C), the resulting supernatant (cell extract) was kept at -20°C. Enzymatic hydrolysis of Spirulina platensis protein with combinations of enzymes pepsin, trypsin and α-chymotrypsin was performed at 37 0C and optimal pH. Enzymatic activity was stopped by boiling at 85 °C for 15 minutes. After centrifugation of hydrolyzed proteins, supernatant was fractionated and analyzed the protein content of samples by Lowry method, degree of hydrolysis progress by ortho-phthalaldehyde (OPA), antioxidant activity by 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2, 2′-azinobis (3-ethyl- benzothiazoline-6-sulphonate) (ABTS) radical scavenging activity and ACE inhibitory activity by using N-[3-(2-furyl) acryloyl]-Phe-Gly-Gly (FAPGG) substrate. Average test outcome that performed in triplicate ± standard deviation was used to present results. Hydrolysis degree of hydrolyzed Spirulina platensis protein with pepsin + trypsin + chymotrypsin enzymes was 15.725 ± 1.260 %µM Leucin/mg protein, pepsin + trypsin 15.294 ± 0.290, pepsin + chymotrypsin 15.191 ± 0.653 and trypsin + chymotrypsin enzymes 11.212 ± 1.031% µM Leucine/mg protein were obtained. The fraction of ˂3 kDa resulted by hydrolysis with pepsin + trypsin enzymes indicated the highest antioxidant activity by scavenging of ABTS and DPPH radicals at 498.21 ±11.53 and 48.650 ± 0.00 µM TE/mg protein, respectively. Antioxidant activity of this fraction was significantly different from other fractions (p˂ 0.05). The IC50 value of ACE inhibitory activity of pepsin + trypsin, pepsin + chymotrypsin and trypsin + chymotrypsin (3.61 ± 0.04 mg/mL) hydrolysates were not significantly different (p> 0.05). Due to the observed antioxidant effects, biopeptides with high antioxidant activity derived from enzymatic hydrolysis of Spirulina platensis protein can be used as functional additives in foods.