بهبود روش باززايي و انتقال ژن به گياه زينتي بنفشه آفريقايي در شرايط كشت درون شيشه‌‌اي

Improving the Method of in Vitro Regeneration and Gene Transfer to the African Violet (Saintpaulia ionantha)

بنفشه آفريقايي يك گياه زينتي تجاري با رنگ هاي مختلف است. به‌منظور باززايي مستقيم، اين گياهچه، ابتدا در آزمايش اول كه به‌صورت آزمايش فاكتوريل در قالب طرح به‌طور كامل تصادفي اجرا شد. اثر ريزنمونه‌هاي برگ، گره، دمبرگ، ريشه، گلبرگ و كاسبرگ در چهار رقم در محيط كشت‌‌ MS‌ حاوي غلظت‌‌هاي مختلف هورمون‌هاي‌‌NAA ‌‌+‌‌BAP‌‌ وIBA +‌‌BAP‌‌ براي توليد شاخساره‌‌ بررسي شد. سپس در آزمايش دوم آستانه تحمل ريزنمونه‌‌‌‌هاي برگ و دمبرگ به آنتي‌‌بيوتيك‌‌هاي هيگرومايسين و كانامايسين با كشت در محيط كشت‌‌هاي انتخابي داراي غلظت‌‌هاي مختلف از اين دو آنتي‌‌بيوتيك ارزيابي گرديد. پس از مشخص شدن غلظت مناسب آنتي‌‌بيوتيك براي محيط كشت انتخابي، انتقال ژن‌‌هاي ‌‌AS1‌‌ و 4'CGT به ترتيب با استفاده از آگروباكتريوم سويه LBA4404 حاوي پلاسميد‌‌هاي pCAMBIA1304 وpBI121 انجام شد. از روش واكنش زنجيره‌‌اي پلي‌‌مراز براي شناسايي گياهان تراريخته استفاده شد. نتيجه‌هاي آزمايش اول مشخص نمود كه ريزنمونه برگ مناسب‌‌ترين ريزنمونه و محيط كشت‌‌ حاوي يك ميلي‌‌گرم بر ليتر IBA و ‌‌‌‌BAP‌‌ در هر چهار رقم، ‌‌بهترين تركيب بود. نتيجه‌هاي آزمايش دوم نشان داد كه محيط M4 (‌‌به ترتيب حاوي 50 و 75 ميلي‌‌گرم در ليتر كانامايسين و هيگرومايسين) به‌طور كامل از باززايي نمونه‌‌هاي غيرتراريخت جلوگيري مي‌‌كند. در انتها گياهان تراريخته با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي ژن‌‌هاي مورد آزمايش انتخاب شدند.

African violet is a commercial ornamental plant with various colors. For direct regeneration, in the first experiment, the effect of leaf, node, petiole, root, petal and sepal explants of four African violet cultivars were evaluated on MS medium containing different concentrations of NAA+BAP and IBA+BAP hormones, which was performed as a factorial in a completely randomized design. In the second experiment, the tolerance threshold of leaf and petiole explants to Hygromycin and Kanamycin antibiotics was evaluated by culturing on selective media supplemented with different concentrations of given antibiotics. After determining the suitable concentrations of the antibiotics for selective medium, the transformation of AS1 and 4'CGT genes was conducted with Agrobacterium LBA4404 strain containing pCAMBIA1304 and pBI121 plasmids, respectively. PCR method was used for the detection of transgenic plants. First experiment revealed that the leaf explant was the best sample and MS medium containing 1 mg L-1 IBA+1 mg L-1 BAP was the best combination for in vitro regeneration of all genotypes. The results of the second experiment showed that the M4 medium (containing 50 and 75 mg L-1 Kanamycin and Hygromycin, respectively) completely inhibited the regeneration of non-transformed samples. Finally, transgenic plants were selected using PCR with specific primers for transferred genes.