امكان تعيين جنسيت با استفاده از DNA آزاد شناور جنيني در پلاسماي خون بز آبستن

The Potential Usefulness of Free Fetal DNA for Prenatal Fetal Gender Determination in Blood Plasma of Pregnant Goat

مقدمه و هدف: امروزه، در پرورش حيوانات اهلي از جمله بز و گوسفند، دستيابي به روشي دقيق، آسان و مقرون به صرفه، پيش‌انتخاب جنسيت جنين، داراي اهميت اقتصادي خاصي مي­باشد. اخيراً، DNAي آزاد جنيني شناور در پلاسماي خون، بعنوان كانديداي مناسبي براي روش تعيين جنسيت غير تهاجمي در دام­ ها و گونه­هاي حيات وحش در خطر انقراض، معرفي شده است. بدين منظور، هدف از پژوهش حاضر، تعيين جنسيت جنين بز به كمك DNAي آزاد جنيني شناور در پلاسماي خون بزهاي آبستن بود. مواد و روش‌ها: در اين راستا، در مجموع، تعداد 21 حيوان آزمايشي شامل 17 بز ماده كه دوره‌ي آبستني بعد شش هفتگي را تجربه مي‌كردند، 2 بز غيرآبستن و 2 بز نر (كنترل منفي) انتخاب شدند. در ادامه تحقيق، بزهاي ماده با استفاده از روش سيدرگذاري در واژن، همزمان‌سازي فحلي انجام و سپس در معرض جفت گيري طبيعي قرار گرفتند. عدم بازگشت به فحلي مجدد به­عنوان شاخص موفقيت در آبستني تلقي شد. همچنين در ماه­ هاي آخر از روش سونوگرافي براي تاييد ابستني استفاده شد. متعاقباً، پس از جداسازي پلاسماي خون بز ماده، استخراج cffDNA با استفاده از دستورالعمل­هاي آزمايشي متداول موجود صورت گرفت. آغازگرهاي اين پژوهش بر اساس ژن آميلوژنين، مستقر در كروموزوم X و Y، طراحي شد. واكنش زنجيره‌اي پلي مراز با استفاده از روش‌هاي استاندارد موجود بهينه‌سازي شد. يافته‌ها: نتايج مولكولي حاصله، وجود دو باند در جنين نر (باند ژن AMELX با اندازه‌ي bp 171 و باند ژن AMELY با اندازه‌ي bp 111) و يك باند در جنين ماده (باند ژن AMELX با اندازه‌ي bp 171) را نشان داد. همچنين بزهاي آبستن در اواخر دوره‌ي آبستني غلظت DNA جنيني بالاتري را نسبت به دوره‌هاي قبلي نشان دادند. نتيجه‌گيري: با مقايسه‌ي نتايج تعيين جنسيت مولكولي پيش از تولد جنين‌هاي تحت آزمايش، با نتايج عملي پس از تولد، دقت تعيين جنسيت با استفاده از ژن آميلوژنين، حساسيت، ويژگي و صحت، 0/83، 0/93 و 0/93 به دست آمد. شايد با كاربري تكنيك حاضر، بتوان در بررسي‌هاي مديريتي تخمين بز جايگزين در گله (سيستم پرورش داشتي) و يا كنترل فروش بزهاي آبستن مازاد، يا پيش‌بيني تعداد بزهاي نر در زايش آتي (سيستم پرواربندي) استفاده كرد.

Introduction and Objective: To date, sex determination technique in domestic animal has economic benefits. Recently, circulating free DNA (cfDNA) highlighted as suitable candidate for non-invasive sex determination in livestock and endangered wild life animals. Based on this motivation, the objective of this report was the potential usefulness of free fetal DNA in maternal blood for prenatal fetal gender determination in pregnant goats. Material and Methods: In this respect, a total of 21 animals, including 17 pregnant females with a gestation period of six weeks, unborn goats and 2 males (negative controls) were selected. During the running experiment, estrous synchronization was performed by intravaginal CIDR. The animals not returned to estrus was considered as an indicator of success in pregnancy. Also in the last months, ultrasound method was used to confirm pregnancy. In the next phase, cffDNA was extracted from the blood plasma of female goats using the available common experimental protocol. The primers in this experiment were designed based on AME gene located on X and Y chromosomes. The polymerase chain reaction was optimized based on available standard methods. Results: The observation addressed existence of two fragment in the male embryo (171 bp AMELX gene band and 111 bp AMELY gene band) and one fragment in the female embryo (171 bp AMELX gene band). Here, most of findings was in line of similar pervious literatures and sex determination based on AME gene in case of sensitivity, specificity and accuracy indices indicated 0.83, 0.93 and 0.93 respectively. Conclusion: On this basis, the results opened a new horizon of the potential usefulness of free fetal DNA in maternal blood for prenatal fetal gender determination in pregnant goats.