ارزيابي عوامل مؤثر در افزايش بازده انتقال ژن به Citrus aurantifolia L به‌واسطه اگروباكتريوم و كاهش شيمري‌شدن شاخساره‌هاي تراريخته

Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated transformation of Citrus aurantifolia L. to increase transformation efficiency and reduce chimeric transgenic shoots

انتقال ژن به ليموترش (.Citrus aurantifolia L)، به‌عنوان يكي از گياهان چوبي سرسخت، چالش‌برانگيز است. تأكيد اين مطالعه بر عوامل مهمي است كه در افزايش موفقيت انتقال ژن و كاستن شيمري شدن شاخساره‌هاي تراريخته، مؤثر هستند. ريزنمونه‌هاي اپي‌كوتيل و ميانگره، با سه سويه اگروباگتريوم (LBA4404، GV3101 و GV3850)، حامل پلاسميدهاي pBI121 و pCAMBIA3301 داراي ژن گزارشگر بتا گالاكتوزيداز (GUS)، جهت بررسي عوامل دخيل در انتقال ژن، استفاده شدند. فاكتورهاي اصلي همچون OD600 اگروباكتريوم (0/3، 0/5 و 1)، زمان تلقيح ريزنمونه (5 ثانيه، 10 دقيقه و 30 دقيقه)، مدت هم‌كشتي (2 و 3 روزه) و انتخاب نوع و ميزان عامل انتخابگرهاي فسفينوترايسين (1، 3، 5 و 10 ميلي‌گرم در ليتر) و كانامايسين (25، 50، 75 و 100 ميلي‌گرم در ليتر) ارزيابي شدند. بدين منظور، بازدهي تراريختي با استفاده از واكنش زنجيره‌اي پليمراز و ميزان حالت شيمري شاخساره‌هاي تراريخته به‌كمك آزمون هيستوشيميايي GUS، تأييد گرديدند. نتايج نشان داد كه اگروباكتريوم سويه LBA4404، با OD600 0/5 و زمان تلقيح پنج ثانيه براي اپي‌كوتيل و 10 دقيقه براي ميانگره با هم‌كشتي دو روزه، مناسب‌ترين تيمارها براي هر دو ريزنمونه بودند. فراواني انتقال ژن بين 0/93% در ريزنمونه ميانگره روي محيط DKW حاوي 1 ميلي‌گرم در ليتر فسفينوترايسين و 14/29 درصد، در ريزنمونه اپي‌كوتيل روي محيط DKW حاوي 50 ميلي‌گرم در ليتر كانامايسين حاصل شد. همچنين مشخص گرديد، به‌كار بردن سطوح بالاي عامل انتخابگر، بازدهي تراريزش را با كاهش پديده شيمري و جلوگيري از فرار شاخساره‌هاي غيرتراريخته، بهبود مي‌بخشد. يافته‌هاي اين مطالعه، راهكارهاي مؤثري را در باززايي شاخساره‌هاي تراريخته غيرشيمري در ليموترش، ارائه مي‌دهد.

Sour lime (Citrus aurantifolia L.) is one of the most important woody plants is widely known for its recalcitrance to genetic transformation. We aimed herein to evaluate effective factors influencing the transformation efficiency and the reduction of chimeric transgenic shoots in sour lime. Epicotyl and internode explants were genetically transformed with different Agrobacterium tumefaciens strains e.g., LBA4404, GV3850, and GV3101, harboring the vectors pBI121 and pCAMBIA3301 containing β-glucuronidase (GUS) as a reporter gene. The effect of the following factors was evaluated: Agrobacterium concentration (OD600=0.3, 0.5 and 1), during inoculation (5 seconds, 10 minutes and 30 minutes), co-culture (2 and 3 days), and the selection regime (phosphinothricin at 1, 3, 5 and 10 mg/l and kanamycin at 25, 50, 75 and 100 mg/l). In following, transformation efficiency and the chimeric transgenic shoots rate were respectively confirmed by PCR and GUS assays. The results showed that Agrobacterium strain LBA4404, at the OD600 of 0.5, with 5 seconds (for epicotyl) and 10 minutes (for internode) inoculation at two-day co-culture period, were identified the most suitable treatments for both explants. The transformation frequencies ranged from 0.93% for internode on DKW medium containing 1.0 mg/l of phosphinothricin to 14.29% for epicotyl on DKW medium containing 50 mg/l of kanamycin. Inclusion of the high-level of selective treatments, improved the transformation rate through decreasing frequency escape and chimeric transgenic shoots. These findings provide novel insights into the appropriate procedure to constitute non-chimeric lime transgenic shoots.