جداسازي و تعيين خصوصيات پروموتر ژن سينامات 4-هيدروكسيلازدر ريحان

Isolation and characterization of cinnamate- 4-hydroxylase gene promoter in Ocimum basilicum L.

اسانس ريحان (Ocimum basilicum L.) سرشار از تركيبات فنيل پروپانوئيدي مانند فنيل سينامات، متيل چاويكول، متيل اوژنول و اوژنول مي­باشد. در مسير بيوسنتز فنيل پروپانوئيدها ژن‌هاي كليدي مهمي از جمله سينامات-4- هيدروكسيلاز دخالت دارد. امروزه با توجه به اهميت پروموتر در دستكاري‌هاي ژنتيكي، انتقال ژن و توليد متابوليت­هاي ثانويه در گياهان، آگاهي از توالي پروموتر و عناصر تشكيل‌دهنده‌ آن ضروري مي­باشد. بنابراين در اين تحقيق با استفاده از روش واكنش زنجيره‌اي پليمراز نامتقارن دمايي (Thermal asymmetric interlaced PCR) توالي ناحيه بالادست ژن سينامات-4- هيدروكسيلاز در گياه ريحان شناسايي شد. در اين تحقيق از دو نوع آغازگر كه از نظر طول و دماي اتصال باهم متفاوت‌ هستند استفاده شد تا توالي هدف تكثير گردد. آغازگرهاي نوع اول اختصاصي با دماي اتصال بالا و داراي سه توالي متفاوت بود. آغازگرهاي نوع دوم اختياري (شش عدد) با طول كوتاه و دماي اتصال پايين بود. واكنش­هاي TAIL- PCR در سه مرحله صورت گرفت كه در مرحله دوم و سوم به ترتيب از فرآورده‌هاي رقيق‌ شده مراحل اول و دوم به‌عنوان DNA الگواستفاده گرديد. بعد از الكتروفورز محصولات PCR و شناسايي باند مورد نظر، قطعه مورد نظر از ژل آگارز استخراج و تلخيص گرديد و توالي يابي آن در دو جهت انجام گرفت. آناليزهاي بيوانفورماتيكي توالي با استفاده از برنامه‌هاي Softberry, PLANT CARE, PLACE وNeural Network Promoter Prediction انجام گرفت و مشخص شد پروموتر مورد نظر 794 جفت باز طول دارد. ناحيه TATA Box اين پروموتر در اطراف نوكلئوتيد 35- و ناحيه شروع رونويسي 170 نوكلئوتيد بالا دست كدون آغاز ترجمه قرار دارد. چندين ناحيه تنظيمي عملكردي نظير CAAT box ،W box، G box و I box نيز در توالي پروموتر شناسايي شد. بنابراين پروموتر شناسايي شده (بعد از ارزيابي و تاييد نهايي) مي­تواند در برنامه­هاي انتقال ژن و دستكاري­هاي ژنتيكي در گياه ريحان جهت افزايش برخي متابوليت­هاي با ارزش استفاده شود.