بهينه سازي بيان آنزيم سلوبيوهيدرولاز cel6B در باكتري E. coli BL21(DE3)

Optimization of cel6B enzyme expression in E. coli BL21 (DE3)

مصرف انرژي و تاثير آن بر محيط‌زيست يكي از بزرگترين چالش‌هاي بشر است و توليد اتانول زيستي يا ساير مواد شيميايي به وسيله هيدروليز آنزيمي سلولز مي‌تواند تاثير مهمي در جايگزيني سوختهاي فسيلي و كاهش توليد CO2 در اتمسفر داشته باشد. آنزيم Cel6B از باكتري گرمادوست Thermobifidia fusca، يك CBHII متعلق به خانواده بي سلولازهاست كه تا C° 55 مقاوم به حرارت است. به علت ميزان پايين توليد اين آنزيم در ميزبان اوليه جهت مصارف صنعتي، ابتدا بايد توليد آن در سيستم‌هايي نظير باكتري، بهينه‌سازي شود. در اين پژوهش، از آغازگرهاي اختصاصي جهت تاييد وجود ژن Cel6B در وكتور PSZ143 استفاده شد سپس وكتور PSZ143 حاوي ژن Cel6B با روش شوك حرارتي به سلول‌هاي مستعد E. coli BL21(DE3) منتقل شد. پس از استخراج پروتئين، بيان يك پروتئين با وزن مولكولي 59.6 KDa با استفاده از ژل الكتروفورز SDS-PAGE تاييد شد. نتايج بهينه‌سازي توليد پروتئين نشان داد كه بهترين زمان و بهترين غلظت IPTG براي القا و بيان پروتئين در باكتري به ترتيب 6 ساعت بعد از القا و 8/0 ميلي‌مولار است. فعاليت آنزيم سلوبيوهيدرولاز با استفاده از سوبستراي پنبه پيش‌تيمار شده با اسيد فسفريك در باكتري ليزشده با روش DNS مورد بررسي قرار گرفت. فعاليت آنزيمي cel6B در هيدروليز سلولز، در ليزات باكتري و محيط‌كشت آن پس از 6 ساعت القا با 8/0 ميلي‌مولار از IPTG ، به ترتيب 21/1 و U(mmol/min) / ml 07/0 به دست آمد و در نهايت نشان داده شد كه ميزان بيان پروتئين cel6B به علت پايين بودن شاخص CAI (انطباق كدوني) و تفاوت كدون‌هاي مورد ترجيح E. coli، پايين است. همچنين با بررسي توالي سيگنال بومي اين ژن در سرويس‌دهنده Signal P4.1 عدم قابليت ترشح اين پروتئين در E. coli اثبات شد.