انتقال ژن به‌روش آگروباكتريوم و تحليل گياهان تراريخت در صنوبر سياه هيبريد (Populus × euromericana Dode Guinier)

Efficient Agrobacterium-Mediated Transformation and Analysis of Transgenic Plants in Hybrid Black Poplar (Populus × euromericana Dode Guinier)

صنوبر سياه هيبريد (Populus × euramericana)، گياهي با كاربردهاي مهم اقتصادي در صنايع خميرچوب و كاغذ، سوخت زيستي و مواد نانوسلولزي و حذف آلودگي‌هاي خاك است. در اين پژوهش، شيوه‌نامه انتقال ژن به‌روش آگروباكتريوم و باززايي مستقيم گياه با استفاده از بافت ميانگره ساقه صنوبر سياه هيبريد ارائه و تحليل مولكولي گياهان تراريخت انجام شد. جهت باززايي گياه كامل از كشت ريزنمونه­هاي ميانگره ساقه در محيط‌كشت القاي ساقه‌زايي حاوي محيط موراشيگ و اسكوگ (MS) و غلظت‌هاي مختلف تركيباتBAP × IBA و براي ريشه زايي (RIM) از محيط‌كشت القاي ريشه‌زايي حاوي غلظت هاي IBA × NAA استفاده شد. با ارزيابي فاكتورهاي فيتوهورموني در باززايي مستقيم، بالاترين ميزان باززايي ساقه (28.57 ساقه در هر ريزنمونه) از ريزنمونه‌هاي كشت شده در محيط‌كشت SIM حاوي 0.5 ميلي‌گرم بر ليتر BAP و 0.05 ميلي‌گرم بر ليتر IBA به‌دست آمد. بهترين ريشه­زايي ساقه­هاي باززا در محيط‌كشت RIM حاوي 0.1 ميلي‌گرم بر ليتر IBA و 0.05 ميلي‌گرم بر ليتر NAA توليد شد. 100 درصد گياهان باززا با محيط سازگار شده و به گلخانه منتقل گرديدند. نتايج مربوط به حساسيت به علف‌كش نشان داد كه 0.5 ميكرومولار Basta® سيستم گزينش دقيقي جهت مهار سلول‌هاي غيرتراريخت فراهم مي‌آورد. بالاترين فراواني انتقال ژن (93.33درصد) از طريق پيش‌كشت ريزنمونه‌ها به‌مدت 6 روز و تلقيح آن‌ها با Agrobacterium tumefaciens سويه LBA4404 ( 0.6=OD600 ) همراه 100 ميكرومولار استوسرينگان به‌مدت 10 دقيقه به‌دست آمد. آناليزهاي لكه‌گذاري سادرن، RT-PCR و آزمون هيستوشيميايي GUS به‌ترتيب درج يك تا دو نسخه ژن gus در DNA ژنومي و بيان پايدار آن‌ را در گياهان نسل T0 منتخب تأييد كرد. يافته‌هاي اين تحقيق مي‌تواند به‌عنوان شيوه­نامه باززايي و انتقال ژن به گياه صنوبر سياه هيبريد مورد بهره‌برداري قرار گيرد.

Black poplar (Populus× euramericana Dode Guinier) is an industrially important tree with broad applications in wood and paper, biofuel and cellulose-based industries as well as plant breeding programs and soil phytoremediation approaches. Here, we have focused on development of direct shoot regeneration and Agrobacterium-mediated transformation protocols using the in vitro internodal stem tissue from hybrid black poplar. To obtain efficient plant regeneration, the internodal stem explant was cultured on SIM and RIM medium containing different concentrations of BAP × IBA and IBA × NAA, respectively. The crucial factors involved in genetic transformation have been evaluated to achieve Agrobacterium-mediated transformation protocol. We achieved fast and highly potential shoot regeneration from the explants cultured on SIM containing BAP 0.5mg/L and IBA 0.05mg/L with 28.57 shoots per explant. The normal roots developed from the plantlets cultured on RIM containing IBA 0.1mg/L and NAA 0.05mg/L and 100% of the regenerated plants were hardened and transferred to the greenhouse condition. Our results indicated that 0.5 μM Basta® could provide a stringent selection for the inhibition of non-transformed cells. We also obtained the highest transformation efficiency of 93.33% through preculturing the explants for 6 days and dipping into IM medium containing A. tumefaciens strain LBA4404 (OD600 = 0.6) and 100 μM AS for 10 min. The Southern blotting analysis, RT-PCR and GUS histochemical analysis were confirmed the stable single or two-copies gus transgenesis in the genomic DNA and its expression in the selected T0 generation plants. The findings indicate that these protocols could be used for genetic engineering approaches in hybrid black poplar