بررسي كارآيي متدهاي تخليص ويزيكول هاي خارج سلولي مشتق از بيفيدوباكتريوم بيفيدوم (يك مطالعه مقايسه ايي)

Evaluation of efficiency of Methods used for extraction of Bifidobacterium bifidum-Derived Extracellular Vesicles: An experimental study

پيش زمينه و هدف: باكتري ها به طور طبيعي وزيكول هايي در مقياس نانو كه حاوي طيف وسيعي از بيومولكول ها مانند پروتئين ها، DNA و RNA هستند را توليد مي كنند. به اين ويزكول ها، وزيكول هاي خارج سلولي (EVs) گفته مي شود. اين وزيكول ها نقش مهمي در تعامل ميزبان و ميكروبيوتا دارند. براي جداسازي EVs روش هاي مختلفي ارائه شده و هر روش داراي مزايا و همچنين محدوديت هايي نيز مي باشد. در مطالعه حاضر ما كارآيي دو روش استخراج EVs را مورد بررسي قرار داده ايم. مواد ورش كار: بيفيدوباكتريوم بيفيدوم در محيط كشت MRS broth در شرايط بيهوازي كشت داده شد. در پروتكل اول از روش اولتراسانتريفيوژ استفاده گرديد (روش اولترا) و در روش دوم از اولتراسانتريفيوژ استفاده نشد (روش غيراولترا). بعد از استخراج ويزيكول ها، ميزان پروتئين آن ها توسط دستگاه Nanodro‎p اندازه گيري شد. از روش SDS-PAGE براي مقايسه الگوي پروتئين EVs استفاده شد. تصاوير SEM از نمونه ها گرفته شده و اندازه آن ها توسط نرم افزار Digimizer ارزيابي شد. يافته ها: نتايج نشان داد كه EVs جدا شده با روش اولترا به طور معني داري ميزان پروتئين بالاتري نسبت به روش غير اولترا(به ترتيب 3/42 و 0/26 mg/ml) داشتند. روش اولترا در مقايسه با روش غيراولترا EVs بيشتر و بزرگتري (حداكثر 235 نانومتر و 117 نانومتر به ترتيب) را جدا كرده بود. همچنين ، الگوي پروتئيني EVs در هر دو روش مشابه بودند. بحث و نتيجه گيري: نتايج ما نشان داد كه روش اولترا سانتريفيوژ روش مناسبتري براي جداسازي EVs بيفيدوباكتريوم بيفيدوم بوده و ويزيكول هاي بيشتر، با پروتئين بالاتر و اندازه مناسب تر تخليص مي كند. با اين حال ، مطالعات بيشتري براي تأييد نتايج ما مورد نياز است.

Background & Aims: Bacteria naturally secret nano-scale vesicles containing a wide range of biomolecules, such as proteins, DNA, and RNA. These vesicles are called extracellular vesicles (EVs). EVs play important roles in host-microbiota interactions. For isolating EVs, different methods have been proposed and each method has its advantages and also limitations. Therefore, in the current study, efficacy of two methods used for extraction of EVs was investigated. Materials & Methods: For this purpose, Bifidobacterium bifidum was cultured in MRS broth under anaerobic conditions. In the first isolation protocol, ultra-centrifugation was used (Ultra-method) and in the second protocol, ultra-centrifugation (Non-Ultra method) was not used. After isolation, protein content was measured by the Nanodro‎p system. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) technique was utilized to compare protein pattern of the EVs. Scanning electron microscopy (SEM) images of the EVs҆ samples were taken and size of the EVs was evaluated by Digimizer software. Results: The results showed that the EVs isolated by the Ultra-method had significantly higher vesicle-associated protein content compared to those isolated by the Non-Ultra method (3.42 and 0.26 mg/ml, respectively). More and larger EVs (up to 235 nm and with frequent size ranging between 100 – 125 nm) were isolated by the Ultra-method compared to the Non-Ultra method (up to 117 nm and with frequent size ranging between 50–75 nm). Also, protein patterns of the EVs were similar in both methods and protein bands were observed at 25 to 250 KDa in both methods. Conclusion: Our results showed that ultra-centrifugation method is a more proper method for isolation of B. bifidum-derived EVs and produces a higher amount of EVs with higher protein content and proper sizes. However, further studies are required to confirm our results.