طراحي، كلونينگ و بيان ژن ctxB-tcpA-c-cpe در اشريشيا كلي به عنوان كانديداي واكسن وبا

Designing, cloning and expression of ctxB– tcpA-c-cpe gene in E.coli as a cholera vaccine candidate

سابقه و هدف: پيلي و زير واحد B توكسين مهمترين عوامل بيماري‌زايي ويبريو كلرا مي‌باشند. در اين پژوهش، از پايانه C توكسين كلاستريديوم پرفرينجنس به عنوان يك سيستم تحويل استفاده گرديد و با ايجاد كايمراي TcpA-CtxB پروتين حاصل در باكتري اشريشيا كلي بيان شد. مواد و روش‌ها: به صورت تجربي، توانايي سازه داراي CtxB-TcpA-CPE در مقايسه با توالي‌هاي پروتيني كامل هر يك از پروتين‌هاي CtxB، TcpA و C-CPE مورد مطالعه قرار گرفت. تكثير قطعات ژني با استفاده از PCR و سپس كلونسازي در وكتورهاي بياني انجام شد. به منظور ساخت سازه، پروتين كايمراي هدف با استفاده از لينكر طراحي و به روش سنتتيك توليد شد. پس از توليد، پروتين‌ها تخليص و سپس با روش ايمونوبلات مورد تاييد قرار گرفتند. يافته ها: پروتين كايمرا توليد شده 484 اسيدامينه داشت. اين تعداد آمينواسيد ميتواند نشان دهنده پايداري پروتين باشد. ژن c-cpe، ژن tcpA و ژن ctxB به ترتيب داراي اندازههاي 381،375 و 675 جفت باز بودند. نتايج هضم آنزيمي و تعيين توالي نشان دهنده‌ي همولوژي نوكلئوتيدي محصولات بدست آمده با توالي ژن‌هاي ثبت شده در NCBI بود. اين ژن‌ها به طور موفقيت آميزي در ميزبان اشريشيا كلي وارد و اندازه باند پروتيني آن‌ها در SDS-PAGE به ترتيب، 15، 25، 25 و 52 كيلودالتون بود. نتيجه‌گيري: براساس مطالعات فيزيكوشيميايي صورت گرفته، به نظر مي‌رسد كه اين پروتين نوتركيب كانديداي خوبي براي بررسي به عنوان واكسن خوراكي ويبريو كلرا باشد كه البته براي اثبات اين فرضيه به انجام آزمون‌هاي چالشي و مطالعات تكميلي بيشتري نياز دارد.

Background & Objectives: TcpA protein and B subunit of cholera toxin are the most important virulence factors of Vibrio cholorea. In the current survey, we applied the C-terminal of clostridium perferingenes toxin as a delivery system to bind the CtxB-TcpA fusion as an antigen, cloning it in a prokaryote vector, evaluated the level of expression. Materials & Methods: In experimental survey, the ability of a constructs based on CtxB-TcpA-C-CPE with complete protein sequences of each protein was studied. After amplification of tcpA, ctxB, and c-cpe genes using PCR, they were cloned in expression plasmids. For fusion protein, all of the three protein sequences were constructed with linker. After expression, the proteins were purified and then confirmed using immunoblot methods. Results: This fusion protein consists of 484 amino acids. PCR amplification for the c-cpe, tcpA and ctxB genes amplified 381, 375 and 675 bp; respectively. The result of enzymatic restrictions and sequencing indicated the exact homology of the synthesized proteins and the others submitted in NCBI. According to the SDS-PAGE results, the TcpA, CtxB, and C-CPE proteins were 15, 25 and 25 kD respectively. Conclusion: According to physicochemical results, this fusion protein may be suitable candidate as a vaccine, however; further experimental trials are needed to approve this conclusion.