اثرحذف ژن موثر در بروز سرطان UCA1 با تكنيك نوين ويرايش ژني CRISPR/Cas9 در رده سلولي سرطان تخمدان

Evaluation of the effects of UCA1 gene knockout with a new CRISPR/Cas9 gene editing technique in ovarian cancer cell line

مقدمه: lncRNAها در رشد سلول، رونويسي، ترجمه و آپوپتوز نقش دارند. UCA1 نوعي lncRNA مهم است كه با پيشرفت سرطان تخمدان ارتباط دارد. بيش از نيمي از زنان مبتلا به سرطان تخمدان در كمتر از پنج سال بعد از تشخيص، از بين مي روند. هدف از اين تحقيق حذف ژن UCA1 با استفاده از تكنيك پيشرفته CRISPR /Cas9 در سلول SK-OV-3 و تعيين اثر آن بر پيشرفت سرطان و آپوپتوز است. روش­ كار: ابتدا با نرم افزار CHOPCHOP، دو نوع sgRNA‌ براي UCA1 طراحي گرديد. اين sgRNA‌ها پس از سنتز، در دو وكتور pSCas9 به صورت جداگانه كلون شدند. سلول­هاي SK-OV-3، با دو وكتور حامل sgRNA‌ها، ترانسفكت شدند. پس از تاييد عملكرد صحيح CRISPR در اين سلول­ها، بيان ژن­هاي P53 ، BAK, BAX و FAS و آنتي‌آپوپتوزي BCL2 و survivin به روش real time PCR ارزيابي گرديد. همچنين ميزان تكثير سلولي و آپوپتوز با MTT و فلوسيتومتري بررسي شد. يافته ها: نتايج نشان دهنده حذف موفق ژن UCA1 در رده سلولي SK-OV-3 بود. بيان ژن­هاي P53، BAK, BAX و FAS در سلول­هاي دستورزي شده نسبت به سلول­هاي شاهد، به صورت معني داري افزايش بيان نشان داد (0/05>p). همچنين، كاهش بيان ژن­ هاي BCL2 و survivin در سلول­هاي دچار حذف ژن نسبت به گروه شاهد، ديده شد (0/05>p). نتايج MTT و فلوسيتومتري مويد كاهش تكثير سلولي و افزايش آپوپتوز بود. نتيجه ­گيري: حذف ژن UCA1 در سلول SK-OV-3، اثرات مثبت در كاهش تكثير و افزايش آپوپتوز نشان داد، لذا جلوگيري از بيان ژن UCA1، نقش موثر در كنترل رشد سلول­ هاي سرطان تخمدان دارد.

Introduction: lncRNAs play their roles in cell growth, transcription, translation, and apoptosis. UCA1 is a type of lncRNA has a direct relationship with ovarian cancer. More than half of the women with ovarian cancer die within less than five years from the disease diagnosis. This study aims to knockout of UCA1 gene using the CRISPR/Cas9 technique in SK-OV-3 cell and studying its effect on cell factors involved in cancer progress and apoptosis. Materials and Methods: Two types of sgRNAs for UCA1 gene were designed. sgRNAs were cloned after synthesis in two vectors of PX459. The SK-OV-3 cell was transfected with two vectors carrying sgRNAs. The expression of FAS, BAK, BAX, and P53 pro-apoptosis genes and BCL2 and SURVIVIN anti-apoptosis genes were evaluated using the q-PCR. Besides, the cell proliferation rate and apoptosis induction were studied using MTT and flowcytometry. Results: The result showed the successful knockout of the UCA1 gene in the SK-OV-3 cell line. The expression of FAS, BAK, BAX, and P53 genes showed a meaningful increase related to the expression in manipulated cells compared to control cells (p˂0.05). Also, the expression decrease of BCL2 and SURVIVIN genes was seen (p˂0.05). MTT and flow cytometry results confirmed the cell proliferation decrease and the apoptosis increase. Conclusion: UCA1 gene Knockout in the SK-OV-3 showed some positive effects in decreasing cancer cell proliferation and increasing the apoptosis rate can be said that inhibiting overexpression of the UCA1 gene will play a positive role in controlling the growth of ovarian cancer cells.