پديد آورندگان :
احمدي بلوطكي، ثريا دانشگاه آزاد اسلامي واحد مرودشت - گروه ژنتيك ، مرودشت، ايران , دوستي، عباس دانشگاه آزاد اسلامي واحد شهركرد - مركز تحقيقات بيوتكنولوژي، شهركرد، ايران , جعفري نيا، مجتبي دانشگاه آزاد اسلامي واحد شهركرد - مركز تحقيقات بيوتكنولوژي، شهركرد، ايران , گودرزي، حامدرضا دانشگاه آزاد اسلامي واحد مرودشت - دانشكدۀ علوم پايه - گروه ژنتيك ، مرودشت، ايران
كليدواژه :
MALAT1 , رده سلولي سرطان سينه , كريسپر , آپوپتوز
چكيده فارسي :
RNAهاي غيركدكنندۀ بلند به‌طور فعال نقش مهمي در تنظيم بيان ژن، پردازش RNA، اصلاح هيستون و بازآرايي ژن‌هاي كروماتين ايفا مي‌كنند؛ همچنين اين مولكول‌ها مي‌توانند در فرايند‌هاي زيست‌شناختي متنوع ازجمله اندام‌زايي، تمايز سلولي، نمو طبيعي، نقش‌پذيري ژنوم، جبران مقدار و روند تومورزايي دخيل باشند. بيان بالاي MALAT1 (نوعي lncRNA) در بسياري از سرطان‌ها، ازجمله سرطان سينه نشان ميدهد كه اختلال تنظيم MALAT1 در رشد بسياري از انواع سرطان‌ها عامل مهمي به‌شمار مي‌رود. سرطان سينه شايع‌ترين سرطان در ميان زنان در سراسر جهان است و تهاجم و متاستاز اين بيماري از علل اصلي مرگ‌ومير مرتبط با آن است. هدف از مطالعۀ حاضر، حذف ژن MALAT1 در ردۀ سلولي MDA-MB-361 سرطان سينه و ارزيابي عملكرد و تأثيرات آن روي بيان ژن‌هاي مرتبط با آپوپتوز است.
مواد و روش ها: در اين مطالعه، دو نوع sgRNA توسط نرم‌افزار CHOPCHOP براي اگزون شمارۀ 1 ژن MALAT1 طراحي شد. اين sgRNAها در دو وكتور كريسپري به‌صورت جداگانه كلون گرديدند تا وكتورهاي نوتركيب PX459-sgRNA1 و PX459-sgRNA2 به وجود آيند. انتقال همزمان اين دو وكتور به ردۀ سلول‌هاي سرطاني MDA-MB-361 با استفاده از ليپوفكتامين 2000 صورت گرفت. ويرايش ژن MALAT1 در سلول‌هاي دريافت‌كنندۀ وكتورهاي كريسپري بررسي شد. ميزان بيان ژن‌هاي مرتبط با آپوپتوز به روش real time PCR آناليز گرديد. ميزان تكثير سلولي و آپوپتوز به‌ترتيب با روش‌هاي MTT و فلوسيتومتري ارزيابي شد.
يافته‌ها: ويرايش ژن MALAT1 به روش كريسپر در سلول‌هاي MDA-MB-361 صورت گرفت. ميزان تكثير سلولي در سلول‌هاي گروه تيمار نسبت به گروه‌هاي كنترل، كاهش معني‌داري نشان داد (P˂0.05). سطح آپوپتوز در سلول‌هاي سرطاني كه ژن MALAT1 آن‌ها حذف گرديده است، با افزايش چشمگيري همراه بود؛ همچنين بيان ژن‌هاي آنتي‌آپوپتوزي BCL2 و survivin در سلول‌هاي تحت تيمار (ويرايش‌شده) نسبت به سلول‌هاي گروه كنترل، به‌صورت معنا‌داري كاهش يافت (P˂0.05). افزايش بيان ژن‌هاي پروآپوپتوزي P53، BAK، BAX و FAS نيز در سلول‌هاي ويرايش‌شده مشاهده گرديد (P˂0.05).
بحث و نتيجه‌گيري: نتايج اين مطالعه تأييد مي‌كند كه حذف ژن MALAT1 در افزايش آپوپتوز و كاهش تكثير سلولي تأثير بسزايي دارد و كاهش بيان ژن MALAT1 مي‌تواند از رشد و تكثير ردۀ سلول سرطان سينه جلوگيري كند؛ بنابراين، به‌نظر مي‌رسد كنترل بيان انكوژن MALAT1 براي كنترل تومورها مفيد و مؤثر است.
چكيده لاتين :
Long non-coding RNAs play an important role in regulating gene expression, RNA processing, histone modification, and rearrangement of chromatin genes. These molecules can also be involved in many biological processes, such as organogenesis, cell differentiation, development, genome imprinting, quantitative compensation, and tumorigenesis. High expression of MALAT1 (a type of lncRNA) in many cancers, including breast cancer, indicates that a disorder of MALAT1 regulation is an important factor in the development of many types of cancer. Breast cancer is the most common cancer among women worldwide, and the invasion, as well as metastasis of this disease, are considered among the main causes of death. The present study aimed to knock out the MALAT1 gene in the MDA-MB-361 breast cancer cell line and evaluate its function and effects on the expression of genes associated with apoptosis.
Material & Methods: In this study, two types of sgRNA were designed by CHOPCHOP software for exon 1 of the MALAT1 gene. These sgRNAs were cloned separately into two CRISPR vectors to generate the recombinant vectors PX459-sgRNA1 and PX459-sgRNA2. Co-transfection of these two recombinant vectors into the MDA-MB-361 cancer cell line was performed using lipofectamine 2000. MALAT1 gene editing was investigated in the cells receiving recombinant vectors. The expression of genes related to apoptosis was analyzed by Real-Time PCR. Cell proliferation and apoptosis were assessed by MTT and flow cytometry methods, respectively.
(Ethic code: IR.IAU.M.REC.1399.010)
Findings: The MALAT1 gene was edited by the CRISPR method in MDA-MB-361 cells. The rate of cell proliferation in the cells of the treatment group, compared to the control groups, showed a significant decrease (P<0.05). Apoptosis levels were significantly increased in cancer cells the MALAT1 gene of which had been deleted. Moreover, the expression of BCL2 and survivin anti-apoptotic genes in treated (edited) cells was significantly reduced, compared to control cells (P<0.05). Increased expression of proapoptotic genes P53, BAK, BAX, and FAS was also observed in the edited cells (P<0.05).
Discussion & Conclusion: The results of this study confirm that the deletion of the MALAT1 gene has a significant effect on increasing apoptosis and reducing cell proliferation. A reduction in the expression of the MALAT1 gene can prevent the growth and proliferation of breast cancer cell lines. Therefore, it seems that the control of MALAT1 oncogene expression is useful and effective for controlling tumors.
